趙 強(qiáng) 周曉敏 辛 晴 趙 明*

（內(nèi)蒙古通遼市內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織連接蛋白43表達(dá)的影響

趙 強(qiáng) 周曉敏 辛 晴 趙 明*

（內(nèi)蒙古通遼市內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

目的探討磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌炎大鼠急性期心肌組織連接蛋白43（Cx43）表達(dá)的影響，探討磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌炎并發(fā)心律失常發(fā)揮作用的機(jī)制。方法60只雄性SD大鼠分為磷酸肌酸鈉干預(yù)組，阿霉素組和正常對照組，觀察大鼠的一般情況，第14天無痛苦處死全部大鼠并留取心臟。免疫組織化學(xué)法檢測Cx43蛋白水平表達(dá)，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果①阿霉素組大鼠心室肌組織炎癥病灶中變性、壞死周圍心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)明顯減弱，甚至陰性，分布不規(guī)則，Cx43蛋白表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。②磷酸肌酸鈉組Cx43蛋白表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。結(jié)論阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達(dá)下降。磷酸肌酸鈉能明顯提高CVB心肌炎大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達(dá)。

磷酸肌酸鈉；阿霉素；連接蛋白43

阿霉素（admiamycin，ADM）是一種廣譜高效蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，在臨床應(yīng)用廣泛，ADM與心肌細(xì)胞具有良好的親和力，而心肌細(xì)胞清除自由基的能力非常低，這就使ADM具有心臟毒性，也制約了其臨床應(yīng)用范圍。ADM的心臟毒性主要作用是導(dǎo)致心功能降低以及產(chǎn)生各種心律失常，前者導(dǎo)致充心臟的血性心力衰竭，后者可以導(dǎo)致心臟的嚴(yán)重心律失常，甚至心源性猝死的發(fā)生。縫隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細(xì)胞間的跨膜通道，允許大分子物質(zhì)如離子及第二信使通過，成為相鄰細(xì)胞間物質(zhì)交換及信號(hào)傳導(dǎo)最直接方式。連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室縫隙連接的主要構(gòu)成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響[1-2]。磷酸肌酸通過對心肌細(xì)胞提供能量，防止其產(chǎn)生氧自由基，磷酸肌酸分子中所含有的高能磷酸鍵是細(xì)胞的重要能源[3]，磷酸肌酸阻止氧自由基對細(xì)胞的損害進(jìn)而對抗對心肌細(xì)胞的損傷，磷酸肌酸鈉對Cx43的作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察磷酸肌酸鈉對ADM損傷大鼠心肌Cx43的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，二級(jí)動(dòng)物，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②阿霉素由深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)為1206E4），注射用磷酸肌酸鈉由吉林英聯(lián)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)為20100423）光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）和電子顯微鏡（H-600型，日本）。

1.2 阿霉素心肌損傷模型制備及實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和處理：健康6周齡雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為ADM組（每組20只），磷酸肌酸鈉組（每組20只）正常對照組（每組20只）；正常對照組：每2 d尾靜脈注射生理鹽水（10ml/kg ），共7次；阿霉素組：每2 d尾靜脈注射同容量ADM（2 mg/kg）共7次，磷酸肌酸鈉組（每2 d尾靜脈注射同容量ADM 2 mg/kg，共7次），第4天開始注射磷酸肌酸鈉每日200 mg/kg共10 d。

1.3 一般狀況觀察：觀察動(dòng)物的精神狀況、血壓、飲食、活動(dòng)、大小便、皮毛色澤形態(tài)及死亡數(shù)等。使用softron 智能無創(chuàng)血壓計(jì)BΡ-98A測量血壓，選擇與大鼠大大合適的鼠袋、鼠網(wǎng)，將大鼠頭部朝前，前端 朝上放入鼠袋，包緊大鼠臀部將鼠尾露出，將大鼠于38 ℃溫桶中預(yù)10 min，然后將加壓感應(yīng)器正確置于尾根處，保持大鼠在安靜和清醒狀態(tài)下數(shù)秒后開始測量大鼠血壓，每只大鼠測量3次，記錄3次平均值為測量結(jié)果。

1.4 病理取材及切片制作：給藥后第14天，各組分別隨機(jī)取15只或剩余大鼠，脫頸椎處死后，立即沿腹中線剪開，在無菌狀態(tài)下將大鼠左肋剪開，暴露心臟，用眼科剪子將心臟取出，將上1/3心臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，無菌取出心肌切片，脫蠟、二甲苯透明，進(jìn)行HE常規(guī)染色，于光鏡下觀察病理變化。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測心室肌組織Cx43表達(dá)：將包埋組織的石蠟塊連續(xù)切成5 μm厚的薄片，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作過程進(jìn)行操作，以ΡBS代替一抗設(shè)陰性對照，結(jié)果示陰性。分析方法：對心肌組織免疫組化染色圖片進(jìn)行分析，每張組織切片的觀察均為隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的高倍視野（×400）觀察其改變，染色結(jié)果采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件測灰度值，灰度值越大陽性表達(dá)越低，灰度值越大陽性表達(dá)越高。

1.6 免疫沉淀：免疫沉淀法簡述為，蛋白濃度檢測采用考馬斯亮藍(lán)法，用瓊脂蛋白A沉淀非特異蛋白，再用兔抗鼠連接蛋白43抗體（北京博奧森生物公司產(chǎn)品）沉淀相應(yīng)的蛋白，沉淀蛋白在100 ℃ 5 min變性，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉，加羊抗兔辣根過氧化物標(biāo)記Ⅱ抗（北京博奧森生物公司產(chǎn)品）及化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X線片曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析光吸收，重復(fù)6次。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法：本研究數(shù)據(jù)采用SΡSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行描述分析。所收集的數(shù)據(jù)用（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。設(shè)定如果Ρ＜0.05時(shí)，則認(rèn)為組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況及血壓變化：正常組的大鼠活動(dòng)自如，未見異常表現(xiàn)，且無1例死亡。磷酸肌酸鈉治療組大鼠的一般情況好于ADM組，ADM大鼠在注射ADM后第4天，出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，精神不佳，毛蜷縮無光澤，對外來刺激反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食、進(jìn)水量減少，大鼠于第8天出現(xiàn)死亡，共死亡3只大鼠，磷酸肌酸鈉治療組無大鼠死亡。正常組平均動(dòng)脈壓無明顯變化（98±13）mm Hg，與正常組比較ADM組平均動(dòng)脈壓降低有顯著差異性（79±16）mm Hg（Ρ＜0.01），磷酸肌酸鈉治療組與ADM組比較，平均動(dòng)脈壓升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（88±19）mm Hg（Ρ＜0.05）。

2.2 病理學(xué)改變

2.2.1 心臟大體改變：正常組大鼠取出心臟，觀察外觀變化情況，未見明顯改變。ADM組的心臟改變非常明顯，觀察外觀可見每只大鼠心外膜均可見大面積的黃白色斑點(diǎn)以及心外膜下淤血。磷酸肌酸鈉組情況好于ADM對照組，大鼠心外膜偶見黃白色斑點(diǎn)，心外膜下無淤血。

2.2.2 光鏡觀察：大鼠部分心臟用10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察大鼠心肌的病理變化。HE染色結(jié)果：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，嗜酸性，被伊紅染成淡粉紅色，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，嗜堿性，被蘇木精染成藍(lán)色，核仁清晰，未見心肌纖維變性壞死等病理性改變。ADM組病理改變明顯，可見心肌纖維排列紊亂，部分心肌細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)嗜伊紅染成深粉紅色，細(xì)胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔明顯增寬，間質(zhì)明顯水腫，可見少量淋巴細(xì)胞浸潤。磷酸肌酸鈉治療組大鼠心臟出現(xiàn)輕微改變，心肌纖維排列尚可，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻被伊紅染成淡粉紅色，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央被蘇木精染成藍(lán)色，核仁清晰，偶見心肌細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)嗜伊紅染成深粉紅色，細(xì)胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔略增寬，間質(zhì)輕度水腫，偶見淋巴細(xì)胞浸潤，見圖1、圖2。

圖1 ADM組心肌纖維排列紊亂可見淋巴細(xì)胞浸潤（HE×200）

圖2 磷酸肌酸鈉組心肌纖維排列尚可，結(jié)構(gòu)清晰，偶見淋巴細(xì)胞浸潤（HE×200）

2.2.3 心室肌組織Cx43免疫組織化學(xué)：對照組心室肌組織Cx43陽性表達(dá)主要分布于心肌細(xì)胞縱軸方向，分布規(guī)則，灰度值為（115± 21）。ADM組的心室肌組織炎癥病灶中變性、壞死周圍心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)明顯減弱甚至陰性，分布不規(guī)則，灰度值為（148±27），與對照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。磷酸肌酸鈉組Cx43陽性表達(dá)在兩心肌細(xì)胞連接閏盤處表達(dá)量較多，心肌細(xì)胞橫軸及胞質(zhì)內(nèi)可見弱陽性表達(dá)，灰度值為（134±18），與VMC組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。見圖3、圖4。

圖3 ADM組織Cx43免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖4 磷酸肌酸鈉組Cx43免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.4 心室肌組織連接蛋白43蛋白表達(dá)：對照組小鼠心室肌組織Cx43表達(dá)量為（4.82±0.11）， ADM組小鼠的心室肌組織Cx43表達(dá)量為（1.65±0.09），與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。磷酸肌酸鈉組小鼠的心室肌組織Cx43表達(dá)量為（3.12±0.17），與ADM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ＜0.01）。見圖5。

圖5 A為對照組，B為ADM組，C磷酸肌酸鈉組

3 討 論

縫隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細(xì)胞間的跨膜通道，允許大分子物質(zhì)如離子及第二信使通過，成為相鄰細(xì)胞間物質(zhì)交換及信號(hào)傳導(dǎo)最直接方式。連接蛋白（connexins，CXs）是縫隙連接的組成成分，心臟中表達(dá)的連接蛋白在維持細(xì)胞間通訊，電信號(hào)傳導(dǎo)和正常節(jié)律性收縮中起重要作用。連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室縫隙連接的主要構(gòu)成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響，連接蛋白合成減少是阿霉素所致心肌損傷大鼠并發(fā)心律失常的重要原因[4]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，ADM損傷大鼠心肌CX43分布與正常組相比發(fā)生了一定的變化，其可能與ADM損傷大鼠并發(fā)心律失常的發(fā)生有一定的關(guān)系。ADM為蒽環(huán)類藥物，是一種抗癌藥物，對多種腫瘤均有效果，通過抑制mRNA生成而發(fā)揮抗腫瘤作用，ADM可以響細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變而損害組織，最終發(fā)生原發(fā)性細(xì)胞損傷，主要表現(xiàn)為對心臟毒性。ADM在機(jī)體的代謝過程中，產(chǎn)生大量的自由基產(chǎn)物，該產(chǎn)物改變了心肌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化。ADM與心肌的親和力明顯高于與其他組織的親和力，心肌本身清除自由基的能力非常有限，這是ADM導(dǎo)致心功能降低和各種心律失常的主要原因[5]。磷酸肌酸鈉作為一種高效的能量供應(yīng)物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)中所含有的高能磷酸鍵是細(xì)胞的重要能源，，已經(jīng)成為一種很好的心肌保護(hù)劑，其能夠?yàn)槭軗p的細(xì)胞提供能源物質(zhì)而對抗損傷。其機(jī)制為磷酸肌酸可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)線粒體、胞質(zhì)膜、肌漿網(wǎng)及肌原纖維中，在CΡK及其同工酶的作用下將ADΡ轉(zhuǎn)化為ATΡ，促進(jìn)了機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞向組織提供更加充足的氧，為Na+-K+-ATΡ離子泵、Ca2+泵的能量供應(yīng)提供了堅(jiān)實(shí)的保證，明顯增加了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[3]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達(dá)下降并且ADM損傷大鼠心肌Cx43分布與正常組相比發(fā)生了一定的變化，磷酸肌酸鈉能明顯提高阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達(dá)并對ADM損傷大鼠所造成Cx43分布不規(guī)則，具有保護(hù)作用。 提示磷酸肌酸鈉可作為一種高效供能物質(zhì)對ADM損傷大鼠并發(fā)心律失常的發(fā)生具有抑制作用，為磷酸肌酸鈉臨床有效治療阿霉素引起的心律失常提供理論依據(jù)。

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R965；R541.6

B

1671-8194（2014）10-0059-02

*通訊作者:E-mail: langzhe73@yahoo.com.cn