趙顯莉，刁　穎，賀銀麗，徐艷峰，郭　珣，李　摯，孫勁旅，高　虹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

金屬是一組常見的接觸性變應(yīng)原，可導(dǎo)致變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)和移植物失敗。鎳是最容易導(dǎo)致ACD的金屬物質(zhì)[1]，并廣泛存在于日常生活環(huán)境中[2-4]。ACD患者接觸部位皮膚可出現(xiàn)邊緣鮮明的損害，輕者可表現(xiàn)為紅斑和丘疹，較重者可能出現(xiàn)水皰和滲液，慢性者還可出現(xiàn)苔蘚樣變、皸裂、脫屑[5]等皮膚病變。ACD確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。動物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制、評價(jià)治療藥物有效性必不可少的實(shí)驗(yàn)工具，建立與臨床發(fā)病過程及病理表現(xiàn)相一致的動物模型能促進(jìn)其相關(guān)機(jī)制研究。本研究利用不同濃度硫酸鎳(NiSO4)為變應(yīng)原，建立2種方案的豚鼠ACD模型，并考察不同接觸時間和接觸皮膚微環(huán)境對模型建立的影響。

材料和方法

試劑和儀器

六水合硫酸鎳(分析純，西隴化工股份有限公司，批號：1209191)；2，4-二硝基氯苯(分析純，批號：970318)；丙酮(分析純，北京化工廠，批號：20100128)；葡萄糖，氯化鈉，氯化銨，尿素，醋酸，乳酸，氫氧化鈉等。豚鼠白介素(interleukin，IL)-2、干擾素(interferon，IFN)-γ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(CUSABIO，96T)。酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，Multiskan Mk3)；高速低速離心機(jī)(BECKMAN COULTER，ALLEGRA-64R)。

實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Hartley豚鼠86只，雌雄各半，體重240～270 g，購自中國食品藥品檢定研究院(實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2009-0017)。豚鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，動物設(shè)施許可證號SYXK(京)2008-0012。

動物分組及致敏方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將豚鼠分為14組，組別命名格式：NiSO4濃度-激發(fā)時間-SP干擾-封閉接觸時間。第0天、第7天、第14天致敏且第28天激發(fā)的8組，即20%Ni-28d-6h、10%Ni-28d-6h、20%Ni-28d-SP-6h、10%Ni-28d-SP-6h、20%Ni-28d-24h、10%Ni-28d-24h、20%Ni-28d-SP-24h、10%Ni-28d-SP-24h，每組5只；第0天、第1天、第2天連續(xù)3天致敏且第9天激發(fā)的6組，即20%Ni-9d-6h、20%Ni-9d-24h、20%Ni-9d-SP-6h、20%Ni-9d-SP-24h、陽性對照組(positive control，PC)、陰性對照組(negative control，NC)，前4組每組9只，2個對照組每組5只。在實(shí)驗(yàn)第0天，豚鼠左側(cè)腹部固定部位(3 cm×3 cm)剃毛后(注意勿損傷表皮)，清水充分擦洗；實(shí)驗(yàn)第0天、第7天和第14天(或第0天、第1天和第2天)按照不同變應(yīng)原和封閉接觸時間(6 h或24 h)連續(xù)3次致敏；實(shí)驗(yàn)第28天(或第9天)于同一固定部位以5% NiSO4單次激發(fā)。同時設(shè)2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)為PC，生理鹽水(normal saline，NS)為NC，并按實(shí)驗(yàn)組第9天激發(fā)的方法致敏。人工汗液(synthetic perspiration， SP)根據(jù)文獻(xiàn)[6]配制，氯化鈉0.1 g/10 ml，氯化銨0.05 g/10 ml，尿素0.05 g/10 ml，醋酸0.025 g/10 ml，乳酸0.05 g/10 ml，再加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=5.5。

皮膚動態(tài)分級

分別于激發(fā)后6、12、24、48和72 h觀察豚鼠激發(fā)部位皮膚反應(yīng)，并根據(jù)激發(fā)部位紅斑和(或)水腫嚴(yán)重程度分為5級[7]：無可見紅斑和(或)水腫為0級，輕度散在紅斑和(或)勉強(qiáng)可見水腫為1級，中度紅斑和(或)邊緣清晰中度水腫為2級，重度紅斑和(或)皮膚隆起約1 mm的水腫為3級，紫紅色紅斑到輕度焦痂形成和(或)皮膚隆起超過1 mm的重度水腫為4級。

皮損組織IL-2，IFN-γ測定

分別采集第9天激發(fā)的6組(20%Ni-9d-6h、20%Ni-9d-SP-6h、20%Ni-9d-24h、20%Ni-9d-SP-24h、PC、NC)豚鼠激發(fā)后24、48、72 h皮損部位的皮膚組織，用PBS溶液洗去血污，濾紙拭干，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取500 mg組織塊，剪成小塊后放入勻漿管中，加入5 ml PBS溶液中制成勻漿。組織處理過程均在冰上進(jìn)行。勻漿置于-20℃過夜，經(jīng)多次反復(fù)凍融處理后，將組織勻漿于4℃ 9 000 r/min離心10 min取上清備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書要求測定，并使用專業(yè)軟件Curve Expert1.3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中待測細(xì)胞因子濃度。

組織病理檢測

豚鼠激發(fā)后72 h，剪取激發(fā)部位皮膚，10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行組織修塊及再固定，制作石蠟切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚的形態(tài)學(xué)變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

激發(fā)部位皮膚反應(yīng)

5%NiSO4激發(fā)后，各組豚鼠激發(fā)部位皮膚均出現(xiàn)不同程度紅斑水腫，紅斑反應(yīng)在20%Ni-28d-SP-24h、20%Ni-9d-SP-6h、20%Ni-9d-SP-24h、20%Ni-9d-24h等組中最為明顯(表1、圖1)，與PC相比，各組豚鼠皮膚水腫均不明顯。

第0天、第7天、第14天激發(fā)的各組中(表1、圖2、3)，激發(fā)后48 h豚鼠皮膚平均紅斑反應(yīng)分值最大，其后逐漸下降；封閉接觸時間為24 h的豚鼠皮膚紅斑平均分值大于封閉接觸時間為6 h的紅斑平均值。第0天、第1天、第2天激發(fā)的各組(圖4、5)，皮膚紅斑反應(yīng)則在激發(fā)后24 h最大；與第0天、第7天、第14天激發(fā)的各組相比，第0、第1天、第2天激發(fā)的各組皮膚紅斑程度更嚴(yán)重。

在致敏過程中，隨著NiSO4濃度增加及封閉接觸時間延長，其紅斑程度增強(qiáng)；NiSO4濃度和封閉接觸時間相同時，加入SP可使紅斑程度明顯增強(qiáng)，20%Ni-28d-SP-24h組紅斑比20%Ni-28d-24h組明顯，且組中多個豚鼠激發(fā)部位皮膚出現(xiàn)瘙癢抓痕。

激發(fā)后72 h皮膚病理變化

5%NiSO4激發(fā)后72 h，各組豚鼠激發(fā)部位皮膚表面出現(xiàn)不同程度的結(jié)痂，表皮增厚，角化過度伴角化不全，真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，真皮及表皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(圖6)。其中第0天、第1天、第2天連續(xù)3 d致敏且第9天激發(fā)的各組，炎性細(xì)胞浸潤明顯多于第0天、第7天、第14天致敏且第28天激發(fā)的各組，能得到較為嚴(yán)重的鎳ACD模型；20%Ni-9d-SP-24h出現(xiàn)真皮乳頭水腫，20%Ni-9d-24h皮突延長明顯，炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重。

皮損組織IL-2和IFN-γ變化

豚鼠激發(fā)后72 h內(nèi)，皮損部位皮膚組織IL-2、IFN-γ的水平隨著變態(tài)反應(yīng)的進(jìn)程而變化。在每個時間點(diǎn)上，4個NiSO4組中細(xì)胞因子的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而從整體上看，在24、48、72 h這3個時間點(diǎn)間，IL-2、IFN-γ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；激發(fā)后48 h IL-2水平達(dá)到峰值(533.53±41.51) pgml并持續(xù)到72 h；激發(fā)后48 h IFN-γ達(dá)到峰值(1 235.63±76.85) pgml并能持續(xù)到72 h(表2)。

表1　硫酸鎳激發(fā)后豚鼠激發(fā)部位皮膚反應(yīng)(紅斑水腫)Table 1　The grouping of laboratory guinea-pigs and skin reactions (erythemaswelling) of each group after challenge

表1　硫酸鎳激發(fā)后豚鼠激發(fā)部位皮膚反應(yīng)(紅斑水腫)Table 1　The grouping of laboratory guinea-pigs and skin reactions (erythemaswelling) of each group after challenge

組別*變應(yīng)原(NiSO4濃度)激發(fā)部位皮膚反應(yīng)(紅斑∕水腫)#6h12h24h48h72h20%Ni-28d-6h20%NiSO41.4∕0.41.4∕0.41.8∕0.42.0∕0.42.0∕0.010%Ni-28d-6h10%NiSO41.2∕0.41.6∕0.82.6∕0.62.6∕0.22.6∕0.020%Ni-28d-SP-6h20%NiSO4+SP2.0∕1.01.6∕0.82.6∕1.02.4∕1.02.0∕0.410%Ni-28d-SP-6h10%NiSO4+SP1.8∕0.61.8∕0.62.6∕1.02.6∕0.82.2∕0.220%Ni-28d-24h20%NiSO4——3.0∕2.02.8∕1.22.4∕0.010%Ni-28d-24h10%NiSO4——3.0∕1.82.8∕0.02.4∕0.020%Ni-28d-SP-24h20%NiSO4+SP——3.4∕2.03.6∕0.82.8∕0.210%Ni-28d-SP-24h10%NiSO4+SP——2.8∕2.83.2∕1.22.8∕0.620%Ni-9d-6h20%NiSO42.5∕1.52.5∕1.03.0∕1.03.0∕1.03.0∕1.020%Ni-9d-SP-6h20%NiSO4+SP3.0∕1.03.0∕1.03.0∕1.03.0∕0.52.0∕0.020%Ni-9d-24h20%NiSO4——3.5∕2.03.0∕1.53.5∕2.020%Ni-9d-SP-24h20%NiSO4+SP——3.5∕1.53.0∕1.53.0∕1.0陽性對照組1%2,4-二硝基氯苯3.0∕0.03.0∕0.04.0∕4.04.0∕4.04.0∕3.0陰性對照組生理鹽水0.0∕0.00.0∕0.00.0∕0.00.0∕0.00.0∕0.0

NiSO4：硫酸鎳；SP：人工汗液；—：封閉時間24 h評分值不可讀；*組別命名格式：NiSO4濃度-激發(fā)時間-SP干擾-封閉接觸時間；#動態(tài)反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)所得豚鼠紅斑/水腫平均值

表2　5%硫酸鎳第9天激發(fā)后24、48、72 h豚鼠皮損組織中白介素-2和干擾素-γ水平Table 2　The level of interleukin-2 and interferon-γ in the skin of guinea-pigs after challenge with 5%

與48、72 h比較，*P<0.05

討　　論

鎳ACD是臨床皮膚科常見病，是由含鎳的金屬合金或電鍍物品引起的變應(yīng)性皮膚疾病。有關(guān)鎳ACD發(fā)病機(jī)制存在多種說法[8-10]，目前公認(rèn)觀點(diǎn)是鎳過敏是一種T淋巴細(xì)胞參與的Ⅳ型遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，可分為誘導(dǎo)致敏和激發(fā)發(fā)病2個階段。與ACD表現(xiàn)類似，鎳ACD患者也會在接觸部位發(fā)生邊緣鮮明損害，輕者為紅斑、丘疹，較重者有水皰、滲液，慢性者還有苔蘚樣變、皸裂、脫屑等臨床表現(xiàn)[11]。為了進(jìn)一步研究鎳ACD的發(fā)病機(jī)制，建立與臨床ACD發(fā)病過程一致的動物模型是研究基礎(chǔ)，也是臨床前藥物評價(jià)的必備工具。豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)與人最為相似，是最普遍使用的檢測化學(xué)物變應(yīng)性動物模型[12]。本研究采用與人類接觸變應(yīng)原相同的途徑進(jìn)行涂抹致敏和激發(fā)，建立豚鼠鎳ACD動物模型。

在臨床上，合金飾品、手機(jī)外殼等含鎳物品一般需在汗液等體液的參與下，緩慢釋放形成二價(jià)的鎳離子才能引發(fā)鎳ACD，且只有在鎳敏感個體皮膚長期接觸的情況下才可能發(fā)生[6]。進(jìn)入接觸部位皮膚的鎳離子濃度也是激發(fā)鎳ACD必不可少的重要因素[13]。國內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道鎳皮炎患者多發(fā)于濕熱的環(huán)境中[14]，更證明了鎳ACD易在濕熱環(huán)境中因長期接觸含鎳物品，且在體液或汗液作用下激活金屬離子而導(dǎo)致緩慢發(fā)病。本研究在組別設(shè)置時增加了不同濃度的SP組，模擬人類致敏的發(fā)病條件，結(jié)果顯示，皮膚出現(xiàn)邊緣鮮明的紅斑反應(yīng)，同時伴有皸裂、脫屑等臨床表現(xiàn)。20%Ni-9d-SP-6h、20%Ni-9d-SP-24h等SP組的紅斑反應(yīng)比不加SP組(20%Ni-9d-6h、20%Ni-9d-24h)明顯增強(qiáng)。同時，激發(fā)后24和48h皮膚紅斑反應(yīng)達(dá)到高峰，隨后逐漸減弱，這與皮損組織中細(xì)胞因子變化一致。此研究結(jié)果提示，在研究藥物對鎳ACD的干預(yù)作用時，終止實(shí)驗(yàn)的時間點(diǎn)應(yīng)選擇在激發(fā)后72h之前，以避免觀察時間過長，致使在實(shí)驗(yàn)終止前炎癥已恢復(fù)正常，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Artik等[15]研究顯示，在鎳ACD致敏過程中，機(jī)體在感染時產(chǎn)生的活性氧離子(reactive oxygen species，ROS)能將二價(jià)的鎳離子(Ni2+)氧化為高價(jià)態(tài)的三價(jià)(Ni3+)和四價(jià)(Ni4+)的鎳離子，而在已損傷的皮膚中更易引起鎳ACD。這一結(jié)果說明鎳的化學(xué)價(jià)態(tài)和微環(huán)境可制約鎳ACD的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，在第0天、第1天、第2天連續(xù)3天致敏的各組中，由于致敏階段封閉接觸部位皮膚皮損較嚴(yán)重，應(yīng)激產(chǎn)生ROS[15]，其變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)于第0天、第7天、第14天連續(xù)3次致敏的各組。在實(shí)驗(yàn)過程中，封閉接觸時間對模型的建立至關(guān)重要。相同的條件下，若由于固定不好或豚鼠自身撕咬等原因造成封閉接觸時間不足，會嚴(yán)重影響模型的皮炎反應(yīng)程度。

鎳ACD患者皮損組織病理表現(xiàn)主要為炎細(xì)胞浸潤，表皮角化不全、棘層肥厚、皮突延長，真皮乳頭血管輕度擴(kuò)張及其周圍組織水腫等；在國內(nèi)外研究報(bào)告中，通過腹腔注射致敏皮下注射激發(fā)的各種小鼠和豚鼠鎳ACD模型，主要表現(xiàn)為真皮淺層水腫及炎細(xì)胞浸潤，不能很好地模擬臨床鎳ACD皮損現(xiàn)象中的紅斑、皸裂、脫皮、表皮角化不全、棘層肥厚、皮突延長等的真實(shí)發(fā)病過程[16-17]。本研究20%Ni-9d-24h組皮炎的各項(xiàng)表現(xiàn)，能較好地模擬臨床鎳ACD皮損組織的病理組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)[18]，提供了與臨床鎳皮炎患者病理表現(xiàn)極為相似的動物模型。

鎳ACD是由變應(yīng)原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并且主要為輔助性T細(xì)胞1，通過釋放IL-2，IFN-γ，腫瘤壞死因子-β等細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤為主的免疫損傷效應(yīng)，少量浸潤的CD8+細(xì)胞主要通過釋放穿孔素和顆粒酶或者誘導(dǎo)凋亡途徑參與組織損傷。IL-2，IFN-γ等細(xì)胞因子在鎳ACD皮膚反應(yīng)中的重要性在動物實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)[19]，是鎳ACD發(fā)生的重要指標(biāo)。在本研究中，IL-2和IFN-γ在激發(fā)后48h明顯增高，以確定鎳ACD的免疫反應(yīng)。

本文根據(jù)OECD經(jīng)典的致敏過程并稍加修改制定建模方案[20]，通過改變致敏條件，可建立不同嚴(yán)重程度的豚鼠鎳ACD模型，為研究鎳ACD提供最能模擬臨床致病過程的動物模型。本研究中豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)無水皰樣改變。人類皮膚由多層上皮細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)強(qiáng)健致密；而嚙齒類動物表皮只有數(shù)層角質(zhì)細(xì)胞覆蓋，表皮與真皮連接面平坦，真皮結(jié)構(gòu)相對松散，血管系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，無法形成細(xì)胞間水腫導(dǎo)致的濕疹和皮膚水皰樣改變[12]。

(本文圖1、3見插頁Ⅰ，圖2、4～6見插頁Ⅱ)

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