黃 芳
結締組織生長因子(CTGF)是CCN家族成員之一[1]。CTGF是一個富含有半胱氨的分泌蛋白,與細胞表面及細胞外基質有關,并且可以與多個整合素相互作用[2-3]。最近的研究表明,CTGF在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也起著重要作用[4-5]。本研究應用pcDNA3.1CTGF過表達載體及siRNA干擾方法,轉染人食管癌Eca109細胞,分別增加細胞CTGF的表達及抑制內源的CTGF的表達,并用INF-γ處理,觀察其對Eca109細胞凋亡的影響。
30例食管癌標本取自2009年無錫市第一人民醫(yī)院胸外科,所有病例均病理檢查證實,取癌旁組織為正常對照。培養(yǎng)食管癌細胞系Eca109使用RPMI 1640培養(yǎng)基,其含有10%FBS,在37℃,5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
通過RT-PCR獲得編碼CTGF全長的cDNA。PCR產(chǎn)物用含有1%EB的瓊脂糖凝膠進行分離,在紫外線下進行切膠純化。在構建Eca109穩(wěn)定的細胞株時,應用Lipofectamin的轉染試劑將CTGF表達載體和對照載體轉染Eca109,并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。最后用600 μg/μl的G418篩選2周,得到克隆后采用Western Blot進行鑒定。
組織標本及細胞的RNA采用前述方法進行制備。用于Real -Time PCR檢測的CTGF引物。并以β-actin作為內參,進行PCR擴增反應。本研究所有的反應均為一式三份,并在iCycler iQ system(Bio-Red)上進行反應。所有引物的擴增產(chǎn)物均要進行溶解曲線和DNA凝膠電泳分析。
免疫組織化學染色采用Envision兩步法進行。食管癌標本和癌旁組織用中性福爾馬林液固定,并進行石蠟包埋,包埋后5 μm連續(xù)切片,并嚴格按Envision兩步法試劑盒說明書進行操作。
當細胞長至80%融合時進行細胞收集,并應用PBS清洗2次,之后應用RIPA Buffer于冰上裂解15 min,然后于4℃下離心細胞裂解液15 min,并用Bradford試劑測定存在的蛋白濃度,然后取等量的蛋白樣品加入6×SDS-PAGE樣品緩沖液,并煮沸5 min,變性后進行10%PAGE電泳,轉膜及顯色。其一抗是鼠抗CTGF單抗,二抗是由HRP標記的鼠抗IgG。
應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的方式表示。采用單因素方差分析的方法進行各組間的比較,檢驗水準α=0.05。
從15例患者的快速冷凍食管癌標本中提取RNA。與癌旁組織相比,CTGF mRNA在73.3%(22/30)食管癌的標本中表達上調。經(jīng)單變量的統(tǒng)計分析結果顯示,兩組CTGF mRNA的表達水平存在差異,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western Blot檢測在配對的癌旁組織和癌組織中CTGF蛋白表達水平與Real-Time PCR檢測的CTGF mRNA表達水平一致。免疫組化染色結果顯示,癌旁組織中CTGF表達很弱,在腫瘤細胞胞質中呈強陽性表達。
構建CTGF表達的食管癌Eca109細胞穩(wěn)定株,并檢測了轉染穩(wěn)定株中CTGF蛋白表達水平,并選擇了兩個不同表達水平的克隆,分別命名為Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M),對照組細胞命名為Eca109/C。在CTGF過表達的Eca109穩(wěn)定菌株中,CTGF蛋白水平顯著高于對照組細胞水平。
應用IFN-γ(500 U/ml)處理細胞24 h后并檢測細胞凋亡情況。流式細胞儀檢測結果顯示,與對照組的細胞凋亡情況相比,Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細胞凋亡指數(shù)分別下降11.95%和4.22%。在IFN-γ處理后,Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組中Bcl-XL蛋白表達水平明顯高于對照組。
在CTGF siRNA轉染的Eca109細胞中,CTGF蛋白水平明顯低于對照組細胞(CTGF siRNA C)。流式細胞儀檢測結果顯示,與對照組相比,CTGF siRNA組細胞凋亡指數(shù)明顯上升(10.16% vs 18.76%)。在IFN-γ處理后,CTGF siRNA組中Bcl-XL蛋白水平低于對照組。
CTGF在創(chuàng)傷修復及纖維化疾病中起重要作用,但是CTGF在腫瘤的發(fā)展、演進[6-7]及腫瘤細胞的存活中也有重要作用[8]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,CTGF 在人食管癌的標本中高表達。
細胞凋亡不僅和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及退化有著密切的聯(lián)系,而且是治療腫瘤的主要目標。本研究發(fā)現(xiàn)上調細胞中CTGF后,用INF-γ處理,可明顯增加其對INF-γ誘導的凋亡的抵抗性;下調CTGF后,其對INF-γ處理誘導的凋亡抗性明顯降低,提示CTGF可能是通過抑制凋亡增加藥物抵抗性。
為了探討CTGF增加細胞凋亡抗性的機制,我們研究了上調CTGF表達及下調CTGF表達,分別用INF-γ處理后,兩組細胞與其對照組細胞相比抗凋亡蛋白Bcl-XL蛋白表達情況。上調CTGF后,對于凋亡的抑制伴有Bcl-XL蛋白表達的增加;下調CTGF后,其對INF-γ誘導凋亡的抵抗性減弱同時伴有Bcl-XL的表達下調。CTGF表達增加和減少分別導致特異性的Bcl-XL蛋白表達的增加和降低,提示Bcl-XL在CTGF誘導的凋亡中起重要作用。
本研究結果顯示用IFN-γ(500 U/ml)處理細胞24 h后并且檢測細胞凋亡情況。流式細胞分析顯示,和Eca109/C組相比,Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細胞凋亡指數(shù)明顯下降(11.95%vs 4.22%)。為了研究CTGF對于IFN-γ介導的凋亡對抗作用的機制,我們檢測了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平變化。在IFN-γ處理后,Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)中,Bcl-XL蛋白表達水平明顯高于對照組。
本研究為了研究內源性的CTGF是否在食管癌細胞中凋亡抵抗起作用,我們用RNAi 介導的慢病毒載體下調Eca109中CTGF的基礎表達水平。為了檢測siRNA轉染是否有效的阻斷了內源的CTGF的表達,我們檢測了CTGF siRNA轉染細胞的CTGF的表達水平。在CTGF siRNA轉染的Eca109細胞中,CTGF蛋白水平明顯低于對照組細胞(CTGF siRNA C)。接下來我們研究干擾CTGF基礎表達對細胞凋亡抵抗的影響。用IFN-γ (500 U /ml)處理細胞24 h并且檢測細胞凋亡情況。流式細胞分析顯示,和CTGF siRNA C組相比,CTGF siRNA組細胞凋亡指數(shù)明顯上升。
本研究為了進一步檢測CTGF siRNA組凋亡指數(shù)的上升是否同樣與抗凋亡蛋白Bcl-XL相關,我們檢測了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平變化。在IFN-γ處理后,CTGF siRNA組中,Bcl-XL蛋白水平低于對照組。Bcl-XL對傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的具有化療抵抗作用最先見于在表達Erb-B2的乳腺癌細胞中Bcl-XL表達上調,同時對三苯氧胺誘導的凋亡有抵抗性[9]。CTGF誘導Bcl-XL的上調與以前的研究結果一致:在乳腺癌中,CTGF的高表達與不良預后相關,并且增加了乳腺癌細胞的遷移[10]。
以上結果表明,CTGF可以顯著增強細胞的凋亡抵抗性,該作用與上調抗凋亡蛋白Bcl-XL有關。由于在標本及細胞中CTGF過表達與其對凋亡的調節(jié)作用一致,CTGF可以看做是食管癌化療敏感性中一個重要決定因素。因此,其可能是食管癌一個新的化療敏感性預測指標,并且可能是一個新的潛在治療靶點。
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