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        3種快速檢測生肉中單核增生李斯特菌的方法研究

        2014-04-02 02:11:52楊晉川王路梅許靜靜
        中國人獸共患病學(xué)報 2014年1期
        關(guān)鍵詞:生肉食源性李斯特

        郭 惠,楊晉川,王路梅,許靜靜,張 雷

        單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,L.m)是一種能引起人獸共患病和食源性疾病的致病菌,廣泛分布于環(huán)境中并通過污染食品引起人類李斯特菌病。 據(jù)近年來食源性致病菌調(diào)查結(jié)果顯示,L.m在生肉中污染率最高[1-2],國內(nèi)相關(guān)研究較少,經(jīng)過初步比較[3-4],選擇熒光定量PCR技術(shù)和磁免疫分離技術(shù)(immunomagnetic separation, IMS)結(jié)合,建立生肉制品中L.m的快速確認方法。

        1 材料與方法

        1.1試驗菌株 (本試驗所用菌株分為2組。目標(biāo)菌株:實驗用L.m54003 購自中國藥品生物制品檢定所,其余5株L.m菌株為揚州疾病預(yù)防控制中心惠贈,分屬于5 種不同血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a 和b)。干擾菌株:以下所用16株標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國藥品生物制品檢定所:溶藻弧菌(ATCC17749)、擬態(tài)弧菌(ATCC33653)、嗜水氣單胞菌(CMCC11801)、腸炎沙門(CMCC50041)、弗氏枸櫞酸桿菌(CMCC11732)、普通變形桿菌(CMCC49101)、肺炎克雷伯菌(CMCC46114)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、臘樣芽孢桿菌(ATCC 11077),產(chǎn)毒性大腸埃希菌(44823),腸致病性大腸桿菌(44814)、宋內(nèi)氏志賀菌 (ATCC 51334)、福氏志賀菌(ATCC 51302)、鼠傷寒沙門菌(ATCC51003),大腸埃希菌(ATCC 25922、8099)。本實驗室分離自食源性疾病標(biāo)本,經(jīng)API系統(tǒng)鑒定并保存的9株菌有:綿羊李斯特氏菌、牛鏈球菌、副溶血弧菌、腸炎沙門菌、O157∶H7 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌O∶3血清型、抗壞血酸克呂瓦菌。

        1.2主要儀器及試劑 Invitrogen Bead Retriever TM自動捕獲系統(tǒng)及L.m免疫磁珠為挪威Dynal公司產(chǎn)品,hlyO基因熒光定量PCR[5]使用引物及 TaqMan探針由上海生工公司合成。Premix Ex Taq 產(chǎn)品。通過ABI 7500 Fast Realtime PCR系統(tǒng)檢測,顯色培養(yǎng)基為法國卡瑪嘉公司產(chǎn)品。引物及探針序列見表1。

        表1 引物及探針序列

        1.3樣品來源 2007-2012年間,在農(nóng)貿(mào)市場采集污染率較高的423份生肉,進行L.m的檢測,陰檢樣品作為模擬樣品進行模擬實驗。

        1.4方法

        1.4.1樣品增菌 選擇Frasher 肉湯進行樣品增菌18 h,用改進的化學(xué)抽提方法提取DNA[5],抽提得到的沉淀用生理鹽水洗2次,溶于20 μL去離子水,加熱煮沸10 min,離心取上清用于擴增。 用熒光定量PCR快速檢測L.mhlyO基因,為Realtime-PCR方法,陽性者,按照說明進行免疫磁珠的捕獲,將10 μL捕獲產(chǎn)物用于顯色培養(yǎng)基分離,可疑菌用熒光定量PCR快速確認,為PCR-IMS法。將樣品增菌液直接用IMS捕獲后用顯色培養(yǎng)基分離,檢測結(jié)果作為評價的標(biāo)準(zhǔn),同時用GB 4789.30-2010國標(biāo)方法進行比對檢測。

        1.4.2Real-time PCR反應(yīng)體系 Premix (2×) 10 μL;PCR引物 (10μmol/L)各0.4 μL; 探針 (10 μmol/L)0.2 μL;DNA模板 2.0 μL;去離子水 7.0 μL,總體系 20 μL。反應(yīng)條件采用兩步法PCR擴標(biāo)準(zhǔn)程序:第1步,預(yù)變性,95 ℃10 s 1 個循環(huán);第2步,PCR反應(yīng)95 ℃5 s,60 ℃20 s,40 個循環(huán)。

        1.4.3特異性試驗 將干擾菌和目標(biāo)菌的新鮮培養(yǎng)液分別稀釋為101-102cfu/mL和102-103cfu/mL加入100 mL樣品增菌液中,再將干擾菌新鮮培養(yǎng)液稀釋為102-103cfu/mL分別加入不同實驗管中,進行上述檢測,重復(fù)3 次。用平板計數(shù)法來計算試驗用菌液濃度。

        1.4.4靈敏性試驗 先將上述的背景菌和干擾菌加入100 mL樣品增菌液中,再將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)株分別稀釋為不同的濃度加入不同實驗管中,以2種方法對同一濃度樣品重復(fù)試驗5~20次,觀察方法的靈敏度,固定主要操作者。

        1.5實際檢測效果評價 對采集的生肉制品同時用國標(biāo)方法和PCR-IMS法進行L.m檢測效果比對。

        2 結(jié) 果

        2.1特異性試驗 Real-time PCR 反應(yīng)中只有L.m有出現(xiàn)陽性結(jié)果,對5種血清類型的目的菌亦有較好的特異性,其他干擾菌均沒有熒光信號。

        2.2敏感性試驗結(jié)果 經(jīng)過預(yù)試驗,國標(biāo)方法檢出低限為500 cfu/10 g,不增菌PCR-IMS方法能檢出目標(biāo)菌含量≥50 cfu/10 g 的樣品,因此選擇該濃度為上限進行敏感性檢測,詳見表2。

        2.3實際檢測效果評價 在423份樣品的檢測中,PCR-IMS法的尤等指數(shù)顯著高其他兩種方法(見表3)。

        表2兩種方法檢測模擬樣品的敏感性(平行管數(shù)20)

        Tab.2Resultofsensitivitybytwomethodsinsimulatedsamples

        Final concentration of Listeria monocy(cfu/10 g)Positive frequency and ratePCR-IMSReal-time PCRBefore enrichment 30-5020/10020/100 10-2019/9520/100 1-1018/9018/90After enrichment 10-2020/10020/100 1-1018/9020/100

        Note: Ct value≤35 as the positive standard.

        3 討 論

        L.m在我國食品中的污染較為嚴(yán)重,同時動物也有帶菌現(xiàn)象,因而具有引起暴發(fā)感染的危險性[1-2]。目前的國標(biāo)方法,耗時較長(至少需要 3~5 d)并且容易受到細菌本身狀態(tài)和多種外界因素影響。PCR-IMS方法應(yīng)用于L.m的快速確證檢測,靈敏度較國標(biāo)方法提高了近百倍,將檢測時限縮短在48 h以內(nèi),敏感度和特異度均>95%,具有很好的診斷價值,可望能作為突發(fā)應(yīng)急事件中病原菌快速篩選和確認方法。

        表3 3種方法檢測實際樣品效果比較

        從上述方法學(xué)的評價來看,real-time PCR結(jié)合改進的化學(xué)抽提法用于初篩,有效去除生肉中的脂類和蛋白質(zhì)的干擾,對模擬樣品和實際樣品的檢測均有較高的特異性和敏感度。而PCR-IMS方法能結(jié)合免疫磁珠的特異性吸附濃縮作用,又進一步提高了快速確證方法的敏感度。PCR-IMS方法用于2007-2011年徐州地區(qū)食源性樣品單增李斯特氏菌的檢測,發(fā)現(xiàn)生肉污染率為5.96%,高于江蘇省內(nèi)的平均水平(4.71%)。

        參考文獻:

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