郭 惠，楊晉川，王路梅，許靜靜,張 雷

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，L.m)是一種能引起人獸共患病和食源性疾病的致病菌，廣泛分布于環(huán)境中并通過(guò)污染食品引起人類李斯特菌病。 據(jù)近年來(lái)食源性致病菌調(diào)查結(jié)果顯示，L.m在生肉中污染率最高[1-2]，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少，經(jīng)過(guò)初步比較[3-4]，選擇熒光定量PCR技術(shù)和磁免疫分離技術(shù)(immunomagnetic separation， IMS)結(jié)合，建立生肉制品中L.m的快速確認(rèn)方法。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株 (本試驗(yàn)所用菌株分為2組。目標(biāo)菌株：實(shí)驗(yàn)用L.m54003 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，其余5株L.m菌株為揚(yáng)州疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)，分屬于5 種不同血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a 和b)。干擾菌株：以下所用16株標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所：溶藻弧菌(ATCC17749)、擬態(tài)弧菌(ATCC33653)、嗜水氣單胞菌(CMCC11801)、腸炎沙門(CMCC50041)、弗氏枸櫞酸桿菌(CMCC11732)、普通變形桿菌(CMCC49101)、肺炎克雷伯菌(CMCC46114)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、臘樣芽孢桿菌(ATCC 11077)，產(chǎn)毒性大腸埃希菌(44823)，腸致病性大腸桿菌(44814)、宋內(nèi)氏志賀菌 (ATCC 51334)、福氏志賀菌(ATCC 51302)、鼠傷寒沙門菌(ATCC51003)，大腸埃希菌(ATCC 25922、8099)。本實(shí)驗(yàn)室分離自食源性疾病標(biāo)本，經(jīng)API系統(tǒng)鑒定并保存的9株菌有：綿羊李斯特氏菌、牛鏈球菌、副溶血弧菌、腸炎沙門菌、O157∶H7 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌O∶3血清型、抗壞血酸克呂瓦菌。

1.2主要儀器及試劑 Invitrogen Bead Retriever TM自動(dòng)捕獲系統(tǒng)及L.m免疫磁珠為挪威Dynal公司產(chǎn)品，hlyO基因熒光定量PCR[5]使用引物及 TaqMan探針由上海生工公司合成。Premix Ex Taq 產(chǎn)品。通過(guò)ABI 7500 Fast Realtime PCR系統(tǒng)檢測(cè)，顯色培養(yǎng)基為法國(guó)卡瑪嘉公司產(chǎn)品。引物及探針序列見(jiàn)表1。

表1 引物及探針序列

1.3樣品來(lái)源 2007-2012年間，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集污染率較高的423份生肉，進(jìn)行L.m的檢測(cè)，陰檢樣品作為模擬樣品進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)。

1.4方法

1.4.1樣品增菌 選擇Frasher 肉湯進(jìn)行樣品增菌18 h，用改進(jìn)的化學(xué)抽提方法提取DNA[5]，抽提得到的沉淀用生理鹽水洗2次，溶于20 μL去離子水，加熱煮沸10 min，離心取上清用于擴(kuò)增。 用熒光定量PCR快速檢測(cè)L.mhlyO基因，為Realtime-PCR方法，陽(yáng)性者，按照說(shuō)明進(jìn)行免疫磁珠的捕獲，將10 μL捕獲產(chǎn)物用于顯色培養(yǎng)基分離，可疑菌用熒光定量PCR快速確認(rèn)，為PCR-IMS法。將樣品增菌液直接用IMS捕獲后用顯色培養(yǎng)基分離，檢測(cè)結(jié)果作為評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)用GB 4789.30-2010國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。

1.4.2Real-time PCR反應(yīng)體系 Premix (2×) 10 μL；PCR引物 (10μmol/L)各0.4 μL； 探針 (10 μmol/L)0.2 μL；DNA模板 2.0 μL；去離子水 7.0 μL，總體系 20 μL。反應(yīng)條件采用兩步法PCR擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)程序：第1步，預(yù)變性，95 ℃10 s 1 個(gè)循環(huán)；第2步，PCR反應(yīng)95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4.3特異性試驗(yàn) 將干擾菌和目標(biāo)菌的新鮮培養(yǎng)液分別稀釋為101-102cfu/mL和102-103cfu/mL加入100 mL樣品增菌液中，再將干擾菌新鮮培養(yǎng)液稀釋為102-103cfu/mL分別加入不同實(shí)驗(yàn)管中，進(jìn)行上述檢測(cè)，重復(fù)3 次。用平板計(jì)數(shù)法來(lái)計(jì)算試驗(yàn)用菌液濃度。

1.4.4靈敏性試驗(yàn) 先將上述的背景菌和干擾菌加入100 mL樣品增菌液中,再將目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)株分別稀釋為不同的濃度加入不同實(shí)驗(yàn)管中，以2種方法對(duì)同一濃度樣品重復(fù)試驗(yàn)5～20次，觀察方法的靈敏度，固定主要操作者。

1.5實(shí)際檢測(cè)效果評(píng)價(jià) 對(duì)采集的生肉制品同時(shí)用國(guó)標(biāo)方法和PCR-IMS法進(jìn)行L.m檢測(cè)效果比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1特異性試驗(yàn) Real-time PCR 反應(yīng)中只有L.m有出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)5種血清類型的目的菌亦有較好的特異性，其他干擾菌均沒(méi)有熒光信號(hào)。

2.2敏感性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，國(guó)標(biāo)方法檢出低限為500 cfu/10 g，不增菌PCR-IMS方法能檢出目標(biāo)菌含量≥50 cfu/10 g 的樣品，因此選擇該濃度為上限進(jìn)行敏感性檢測(cè)，詳見(jiàn)表2。

2.3實(shí)際檢測(cè)效果評(píng)價(jià) 在423份樣品的檢測(cè)中，PCR-IMS法的尤等指數(shù)顯著高其他兩種方法(見(jiàn)表3)。

表2兩種方法檢測(cè)模擬樣品的敏感性(平行管數(shù)20)

Tab.2Resultofsensitivitybytwomethodsinsimulatedsamples

Final concentration of Listeria monocy(cfu/10 g)Positive frequency and ratePCR-IMSReal-time PCRBefore enrichment 30-5020/10020/100 10-2019/9520/100 1-1018/9018/90After enrichment 10-2020/10020/100 1-1018/9020/100

Note: Ct value≤35 as the positive standard.

3 討 論

L.m在我國(guó)食品中的污染較為嚴(yán)重，同時(shí)動(dòng)物也有帶菌現(xiàn)象，因而具有引起暴發(fā)感染的危險(xiǎn)性[1-2]。目前的國(guó)標(biāo)方法，耗時(shí)較長(zhǎng)(至少需要 3～5 d)并且容易受到細(xì)菌本身狀態(tài)和多種外界因素影響。PCR-IMS方法應(yīng)用于L.m的快速確證檢測(cè)，靈敏度較國(guó)標(biāo)方法提高了近百倍，將檢測(cè)時(shí)限縮短在48 h以內(nèi),敏感度和特異度均>95%,具有很好的診斷價(jià)值,可望能作為突發(fā)應(yīng)急事件中病原菌快速篩選和確認(rèn)方法。

表3 3種方法檢測(cè)實(shí)際樣品效果比較

從上述方法學(xué)的評(píng)價(jià)來(lái)看，real-time PCR結(jié)合改進(jìn)的化學(xué)抽提法用于初篩，有效去除生肉中的脂類和蛋白質(zhì)的干擾，對(duì)模擬樣品和實(shí)際樣品的檢測(cè)均有較高的特異性和敏感度。而PCR-IMS方法能結(jié)合免疫磁珠的特異性吸附濃縮作用，又進(jìn)一步提高了快速確證方法的敏感度。PCR-IMS方法用于2007-2011年徐州地區(qū)食源性樣品單增李斯特氏菌的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生肉污染率為5.96%，高于江蘇省內(nèi)的平均水平(4.71%)。

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