韋永芳，陳代雄，梁成結(jié)，羅曉東，朱郇憫

廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongyluscantonensis)是引起嗜酸粒細(xì)胞增多性腦膜炎和腦膜腦炎的重要病原體。人多因食生或半生含有廣州管圓線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)的中間宿主(如褐云瑪瑙螺等)而感染。由該蟲(chóng)引起的廣州管圓線蟲(chóng)病已在多個(gè)國(guó)家先后暴發(fā)[1-4]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為長(zhǎng)爪沙鼠(Mongolian gerbil，Meriones unguiculatus)對(duì)多種原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和吸蟲(chóng)等實(shí)驗(yàn)性感染易感，現(xiàn)已成功建立了包括馬來(lái)絲蟲(chóng)、藍(lán)氏賈弟鞭毛蟲(chóng)、微小膜殼絳蟲(chóng)、類圓線蟲(chóng)等多種寄生蟲(chóng)的長(zhǎng)爪沙鼠感染動(dòng)物模型[5-9]，本研究以廣州管圓線蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠，以探討廣州管圓線蟲(chóng)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的致病性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1褐云瑪瑙螺(Achatinafulica) 采集自廣州市番禺區(qū)。

1.1.2長(zhǎng)爪沙鼠 體重45～60 g之間，雌雄各半，由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(粵)2010-0104]。

1.2方法

1.2.1廣州管圓線蟲(chóng)第3期幼蟲(chóng) 參照李華等[10]報(bào)道的方法從褐云瑪瑙螺中分離。將褐云瑪瑙螺去殼，稱重后剁碎，每1 g螺肉加入20 mL人工消化液(配置方法:每1 000 mL消化液含3 g胃蛋白酶、7 mL濃鹽酸、993 mL水)，37 ℃恒溫箱中消化2 h后經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液靜置30 min后，置于方皿中，解剖鏡下檢查廣州管圓線蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)(L3)。

1.2.2動(dòng)物感染 參照陳代雄等[11]方法進(jìn)行。長(zhǎng)爪沙鼠稱重后，隨機(jī)分為對(duì)照組20只，腹腔注射生理鹽水；感染組50只，腹腔注射廣州管圓線蟲(chóng)第3期幼蟲(chóng)，10條/鼠。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1動(dòng)物一般行為觀察 觀察感染后長(zhǎng)爪沙鼠的生理學(xué)變化，記錄長(zhǎng)爪沙鼠的死亡情況。

1.3.2檢獲蟲(chóng)體數(shù)和蟲(chóng)體的組織分布 分別在感染后不同時(shí)間(第7、21、28、35、46 d)剖殺部分感染的長(zhǎng)爪沙鼠和檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程中瀕死或死亡的感染沙鼠，分離腦和心肺組織，先用肉眼及解剖鏡觀察，如有幼蟲(chóng)則檢獲，余下組織經(jīng)充分撕碎后加人工消化液置于37 ℃水浴箱消化2 h，再行過(guò)濾、沉淀，解剖顯微鏡下檢獲蟲(chóng)體。記錄各組織中檢獲的雌雄蟲(chóng)體數(shù)量，并觀察蟲(chóng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.3組織病變觀察 分離感染后不同時(shí)間的腦和肺組織，肉眼觀察其病變特點(diǎn)；福爾馬林固定后，進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE染色。

2 結(jié) 果

2．1動(dòng)物一般行為變化 長(zhǎng)爪沙鼠在感染后第8 d即有不同程度食欲減退、萎靡、活動(dòng)減少等；約第16 d部分沙鼠出現(xiàn)被毛散亂、閉眼、脊柱側(cè)彎等癥狀；感染后第17～18 d，部分長(zhǎng)爪沙鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，打轉(zhuǎn)和癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，隨著時(shí)間推移，出現(xiàn)這些癥狀的長(zhǎng)爪沙鼠數(shù)量增加，癥狀也逐漸加重，出現(xiàn)不同程度進(jìn)食和飲水困難。感染后第23 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，23～30 d為死亡的高峰時(shí)間，瀕死或死亡的沙鼠共28只；除了剖殺和死亡外，最終有12只能生存至感染后第46 d。

2．2檢獲蟲(chóng)體數(shù) 對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠腦組織均未檢獲到廣州管圓線蟲(chóng)。感染后第7 d未能從腦組織中檢獲蟲(chóng)體；感染后第23～46 d檢查鼠35只(包括活的、頻死的和死的)，共檢獲蟲(chóng)體127條(♀62/♂65)，蟲(chóng)體收獲率約為36.29%(127/350)，平均蟲(chóng)數(shù)為(3.63±1.46)/鼠。感染后第21 d長(zhǎng)爪沙鼠腦組織中即檢獲出第Ⅴ期幼蟲(chóng)，感染后腦中的蟲(chóng)體數(shù)量隨時(shí)間呈現(xiàn)出不規(guī)則上升，23～30 d達(dá)峰值后逐漸下降；而第27～30 d后，心肺組織中呈現(xiàn)出不規(guī)則上升，檢獲的蟲(chóng)體大部分已發(fā)育成Ⅴ期幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)，至41 d后發(fā)育為性成熟的成蟲(chóng)，感染后第46 d從存活的12只沙鼠的肺動(dòng)脈中均檢獲到雌雄蟲(chóng)寄生和單性寄生蟲(chóng)體，6只為雌雄蟲(chóng)寄生，其中4只糞便中查到廣州管圓線蟲(chóng)Ⅰ期幼蟲(chóng)((圖1 A1-A2)；6只為單性蟲(chóng)體寄生，糞便中均未查到Ⅰ期幼蟲(chóng)。長(zhǎng)爪沙鼠感染廣州管圓線蟲(chóng)L3不同時(shí)間后，其腦和心肺內(nèi)蟲(chóng)體的分布見(jiàn)表1。

表1 感染后不同時(shí)間長(zhǎng)爪沙鼠的腦和心肺組織檢獲的蟲(chóng)體數(shù)

Note: * Brain and lung of other 10 infected gerbils were used for pathological examination.

2.3病理變化

2.3.1肉眼觀察 長(zhǎng)爪沙鼠感染廣州管圓線蟲(chóng)后第7 d腦組織病理變化不明顯。感染后第23 d，長(zhǎng)爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹?，可?jiàn)腦組織表面有不同程度的血管擴(kuò)張與充血、出血及粘連；而肺部呈彌漫性充血改變。感染后第38～46 d，以肺部病變?yōu)橹?，肺組織表現(xiàn)為不同程度局灶性充血腫脹，表面及切面質(zhì)硬粗糙呈灰白色顆粒狀，還可見(jiàn)到點(diǎn)狀小片狀出血灶；腦組織病變較輕，只有局限性血管擴(kuò)張和充血(圖2 A1-B3)。

2.3.2病理切片觀察 感染后第25 d蛛網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)蟲(chóng)體，蟲(chóng)體周圍有出血。第38 d，蛛網(wǎng)膜下腔仍可見(jiàn)蟲(chóng)體，肺內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)橢圓形蟲(chóng)卵；第45 d，肺內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)橢圓形蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵為多細(xì)胞期或幼蟲(chóng)期，部分肺泡輪廓消失和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1檢獲的廣州管圓線蟲(chóng)

Fig.1WormrecoveryofA.cantonensis

A: Adult worm; B:A.cantonensis1st-stage larvae in stools (10×10)

圖2 長(zhǎng)爪沙鼠感染廣州管圓線蟲(chóng)后腦和心肺組織的變化

3 討 論

大鼠和小鼠是目前多數(shù)使用的廣州管圓線蟲(chóng)感染動(dòng)物模型，大鼠是廣州管圓線蟲(chóng)的適宜終宿主，而小鼠、豚鼠、兔、恒河猴和人類是其非適宜宿主，廣州管圓線蟲(chóng)可通過(guò)適宜宿主大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)移行到肺動(dòng)脈，并在心肺發(fā)育成熟；非適宜宿主，大多數(shù)L3幼蟲(chóng)移行到腦，經(jīng)歷兩次蛻皮，未成熟的成蟲(chóng)移行到蛛網(wǎng)膜下腔，但在心肺未能發(fā)育為性成熟[12-15]。以往的研究證實(shí)長(zhǎng)爪沙鼠是一種對(duì)多種寄生蟲(chóng)易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是馬來(lái)絲蟲(chóng)、微小膜殼絳蟲(chóng)(肥頭絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng))的終宿主，幼蟲(chóng)可在沙鼠中建立、生長(zhǎng)、發(fā)育到妊娠的成年階段[5,7],此外也用于線蟲(chóng)的感染，如棘唇線蟲(chóng)、類圓線蟲(chóng)、美洲板口線蟲(chóng)等[8，17-19]。長(zhǎng)爪沙鼠用于廣州管圓線蟲(chóng)感染研究很少見(jiàn)于報(bào)道[20-21]。過(guò)往的研究中長(zhǎng)爪沙鼠被認(rèn)為是廣州管圓線蟲(chóng)適宜宿主但不大易感，我們的研究結(jié)果顯示廣州管圓線蟲(chóng)在感染沙鼠后約3周開(kāi)始從腦移行至肺，在肺中發(fā)育至成蟲(chóng)并產(chǎn)卵，與大鼠的情況相似[22]，符合適宜宿主特點(diǎn)。然而感染后第46 d，仍有部分蟲(chóng)體滯留于腦，且到達(dá)肺的蟲(chóng)體仍有個(gè)別未完全發(fā)育成熟；此外，與大鼠比較[12-15]，長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)感染耐受性明顯較差，曾腹腔注射35條幼蟲(chóng)/鼠、15條幼蟲(chóng)/鼠廣州管圓線蟲(chóng)第3期幼蟲(chóng)，第32 d 80%以上的沙鼠死亡，即使感染蟲(chóng)數(shù)減為10條幼蟲(chóng)/鼠，感染后第30 d 62%的沙鼠死亡。

長(zhǎng)爪沙鼠通常在感染2周后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如步態(tài)不穩(wěn)，打轉(zhuǎn)和癱瘓等，感染3周后出現(xiàn)死亡；在感染后第23～46 d，腦內(nèi)蟲(chóng)體數(shù)量逐漸減少，肺內(nèi)蟲(chóng)體數(shù)量逐漸增加(表2)，提示蟲(chóng)體由腦向肺移行。肉眼和病理檢查結(jié)果提示長(zhǎng)爪沙鼠感染后30 d 內(nèi)以腦損害為主，表現(xiàn)為腦膜充血、出血及粘連等特點(diǎn)的嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎。30 d后以肺部損害為主，成蟲(chóng)可在肺部產(chǎn)卵形成蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)，表現(xiàn)肉芽腫性肺炎[23]，這與大鼠的病理?yè)p傷一致[24]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)感染后腦組織中未查出蟲(chóng)體的長(zhǎng)爪沙鼠的腦組織變化程度明顯輕微，出現(xiàn)癥狀的時(shí)間也推后，推測(cè)這與蟲(chóng)數(shù)多寡在腦組織中的移行造成腦組織的機(jī)械損傷,以及蟲(chóng)體的代謝、分泌產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物導(dǎo)致了腦組織非特異性炎性病變反應(yīng)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang QP, Lai DH, Zhu XQ, et al. Human angiostrongyliasis[J]. Lancet Infect Dis, 2008, 8(10): 621-630. DOI:10.1016/S1473-3099(08)70229-9

[2]Qu ZY, Zhan XM, He A. The analysis on epidemic situation of angiostrongyliasis in China[J]. Int J Med Parasit Dis, 2007, 34(5): 279- 283.

[3]Lindo JF, Waugh C, Hall J. EnzooticAngiostrongyluscantonensisin rats and snails after an outbreak of human eosinophilic meningitis, Jamaica[J]. Emerg Infect Dis,2002, 8(3): 324-326. DOI:10.3201/eid0803.010316

[4]Chen DX, Zhang Y, Shen HX, et al. Epidemiological survey ofAngiostrongyluscantonensisin the west-central region of Guangdong Province, China[J]. Parasitol Res, 2011, 109: 305-314. DOI:10.1007/s00436-011-2255-1

[5]Ash LB, Riley JM. Development of subperiodicBrugiamalayiin the jird,Merionesunguicudatus, with notes on infenctions in other rodents[J]. J Parasitol, 1970, 56: 969-973.

[6]Majewska AC. Successful experimental infections of a human volunteer and Mongolian gerbils withGiardiaof animal origin[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1994, 88(3): 360-362.

[7]Johnson SS, Conder GA. Infectivity ofHymenolepisdiminutafor the jird,Merionesunguiculatus, and utility of this model for anthelmintic studies[J]. J Parasitol, 1996, 82(3): 492-495.

[8]Nolan TJ, Megyeri Z, Bhopale VM, et al.Strongyloidesstercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Merionesunguiculatus)[J]. J Infect Dis, 1993, 168(6): 1479-1484.

[9]Tsuji N, Nakamura Y, Taira N. Long-lasting parasitism ofStrongyloidesvenezuelensisin Mongolian gerbils (Merionesunguiculatus)[J]. J Parasitol, 1993, 79(2): 305-307.

[10]Li H, Chen XG, Shen HX, et al. Antigen analysis ofAngiostrongyluscantonensisin different developmental stages[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2005, 23(1): 36-39.

[11]Chen DX, Shen HX, Li XM, et al. Infection ofAngiostrongyluscantonensisand amplification of the specific myoprotein-1 gene[J]. J Mod Clin Med Bioengineer, 2003, 9(3): 244-245, 247. (in Chinese)

陳代雄,沈浩賢,李小敏,等.廣州管圓線蟲(chóng)感染的觀察與成蟲(chóng)特異性肌蛋白-1基因的擴(kuò)增[J]. 現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志, 2003, 9(3): 244-245, 247.

[12]Lan KP, Lai SC. Differences of proteolytic enzymes and pathological changes in permissive and nonpermissive animal hosts forAngiostrongyluscantonensisinfection[J]. Vet Parasitol, 2009, 165(3-4): 265-272. DOI:10.1016/j.vetpar.2009.07.029

[13]OuYang LS, Wei J, Wu ZD, et al. Differences of larval development and pathological changes in permissive and nonpermissive rodent hosts forAngiostrongyluscantonensisinfection[J]. Parasitol Res, 2012, 111(4): 1547-1557. DOI:10.1007/s00436-012-2995-6

[14]Alicata JE. Biology and distribution of the rat lungworm,Angiostrongyluscantonensis, and its relationship to eosinophilic meningoencephalitis and other neurological disorders of man and animals[J]. Adv Parasitol, 1965, 3: 223-248.

[15]Yamashita T, Sato Y, Shiraki T, et al. Development ofAngiostrongyluscantonensisin rats, mice and guineapigs[J]. Japan J Parasitol, 1975, 24: 114-121.

[16]Aoki M, Sugaya H, Ishida K. et al. The role of CD4+and CD8+T-cells in host morbidity and innate resistance to angiostrongylus cantonensis in the mouse[J]. Parasitol Res, 1998, 84(2): 91-99.

[17]Eisenbeiss WF, Apfel H, Meyer TF, et al. Recovery, distribution, and development ofAcanthocheilonemaviteaethird- and early fourth-stage larvae in adult jirds[J]. J Parasitol, 1991, 77(4): 580-586.

[18]Cho S, Egami M, Ohnuki H, et al. Migration behaviour and pathogenesis of five ascarid nematode species in the Mongolian gerbilMerionesunguiculatus[J]. J Helminthol, 2007, 81(1): 43-47. DOI:10.1017/S0022149X07212118

[19]Conder GA, Johnson SS, Guimond PM, et al. Concurrent infections with the ruminant nematodesHaemonchuscontortusandTrichostrongyluscolubriformisin jirds,Merionesunguiculatus, and use of this model for anthelmintic studies[J]. J Parasitol, 1991, 77(4): 621-623.

[20]Yoshimura K, Kawashima Y. Observations on the development ofAngiostrongyluscantonensisin mastomys and mongolian gerbils[J]. Nihon Juigaku Zasshi, 1978, 40(6): 745-748.

[21]Sugaya H, Yoshimura K. T-cell-dependent eosinophilia in the cerebrospinal fluid of the mouse infected withAngiostrongyluscantonensis[J]. Parasit Immunol, 1988, 10(2): 127-138.

[22]Zhu TC, Ding BL, Luo XP. Migration, development ofAngiostrongyluscantonensisin rats and its pathological damage for host[J]. Acad J Guangzhou Med Coll, 1983, 11(4): 8-28. (in Chinese)

朱天成, 丁布蘭, 羅肖萍. 廣州管圓線蟲(chóng)在大鼠體內(nèi)的移行、發(fā)育及其引起的病理?yè)p害的實(shí)驗(yàn)觀察[J]. 廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1983, 11(4): 8-28.

[23]Hsu CC, Lai SC. Matrix metalloproteinase-2, -9 and -13 are involved in fibronectin degradation of rat lung granulomatous fibrosis caused byAngiostrongyluscantonensis[J]. Int J Exp Pathol, 2007, 88(6): 437-443. DOI:10.1111/j.1365-2613.2007.00554.x

[24]Li XH, Zhang RL, Chen MX, et al. Immunohistochemical and pathological study of the lung of rat infected byAngiostrongyluscantonensis[J]. J Trop Med, 2009, 9(8): 852-853. (in Chinese)

李曉恒, 張仁利, 陳木新, 等. 廣州管圓線蟲(chóng)感染致大鼠肺組織病理改變及免疫組化研究[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 9(8): 852-853.