劉洋　張麗華

[摘要] 目的 探討鹿鞭及牛鞭線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征，建立中藥材鹿鞭敏感、特異的DNA分子標(biāo)記學(xué)鑒定方法。方法 對(duì)市售鹿鞭進(jìn)行樣本處理，模板制備，采用鹿鞭特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)市售鹿鞭樣本采取DNA指紋鑒定。結(jié)果 對(duì)市售鹿鞭中藥材進(jìn)行mtDNA鑒定，有三個(gè)樣本為正品。結(jié)論 此方法對(duì)市售鹿鞭鑒定，可準(zhǔn)確辨別正品與偽品。重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確而可行，說(shuō)明鹿鞭mtDNA具有特異性指紋特征，所得鹿鞭D(zhuǎn)NA指紋特征圖譜可用于市售鹿鞭的鑒定。

[關(guān)鍵詞] 市售鹿鞭；線粒體DNA；DNA指紋鑒定

[中圖分類號(hào)] R282.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）02-50-03

20世紀(jì)80年代，由于分子分類學(xué)的出現(xiàn)，使人們從研究生物形態(tài)表征進(jìn)入到生物的DNA遺傳物質(zhì)。人們可以根據(jù)DNA系列的差異來(lái)鑒定生物物種，是因?yàn)橥N生物體有相同的DNA系列，不同種生物有不同DNA系列。除了礦物類藥材外大多數(shù)藥材是從動(dòng)植物中得到，動(dòng)植物藥材一般從死亡的干燥生物或者其組織器官中來(lái)。隨著生物體的逐漸死亡，DNA會(huì)被核酸酶大量降解，使藥材中DNA的分析有一定難度。近些年，分子生物學(xué)發(fā)展速度很快，尤其是微量DNA提取技術(shù)與PCR擴(kuò)增技術(shù)，使從藥材中提取分析微量的DNA成為可能，也為藥材進(jìn)行DNA技術(shù)鑒定提供了可能。DNA分析技術(shù)使中藥材和與其容易混淆品種之間如何更好地鑒定找到了一個(gè)好辦法。mtDNA是遺傳信息的載體，它被認(rèn)為是動(dòng)物起源進(jìn)化的研究和分析群體遺傳的最佳對(duì)象，Cytb進(jìn)化速度適中，是分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)?shù)腄NA片段，可以應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究 。本研究旨在探索將DNA指紋鑒定技術(shù)應(yīng)用于市售鹿鞭鑒定中，以此提高其鑒定準(zhǔn)確性[1]。

1 材料與儀器

1.1 一般材料

1.1.1 樣本 市售的鹿鞭由吉林市參茸市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買，共2批，抽取6個(gè)樣本，編號(hào)為：1、2、3、4、5、6。干品牛鞭樣本，編號(hào)為7。鹿鞭及其偽充藥材均經(jīng)吉林市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定。

1.1.2 酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Taq酶：購(gòu)自北京鼎國(guó)公司，λDNA/HindⅢ：購(gòu)自TIANGEN公司，DNA MarkerⅠ：購(gòu)自TIANGEN公司。

1.1.3 主要化學(xué)試劑 瓊脂糖：購(gòu)England，dNTP及PCR緩沖液：購(gòu)自北京置鼎國(guó)公司，其他常用化學(xué)試劑：國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)：上海醫(yī)用分析儀器廠，H-2050R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Becman公司。

2 方法

2.1 樣本的前處理

將市售鹿鞭中藥材6個(gè)樣本及干品牛鞭的龜頭及陰莖部分，用粉碎機(jī)粉碎處理，將粉碎后的干燥纖維置于4℃保存，備用。

2.2 模板的制備

取粉碎后的市售鹿鞭6個(gè)樣本及干品牛鞭1個(gè)樣本各1.0g，徹底清洗后紫外照射30min，分別轉(zhuǎn)入25mL離心管中，加入10倍左右的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），56℃保溫72h。4000rpm 4℃離心15min，倒掉上清液。加入裂解液5mL，56℃水浴中保溫過(guò)夜，至組織完全消化溶解。消化液用等體積飽和酚抽提1次，等體積酚-氯仿抽提2次，氯仿-異戊醇（24∶1）抽提1次。加入2倍體積的-20℃的無(wú)水乙醇，混勻放于冰箱中過(guò)夜。15000rpm 4℃離心30min，真空干燥，溶解于TE緩沖液。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

以提取的市售鹿鞭和干品牛鞭mtDNA為模板，滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系30μL，在0.5mL PCR反應(yīng)管中依次加入10×PCR buffer 5μL，1.25mmol/L dNTP 4μL，10pmol/L引物1和引物2各2.0μL，Taq DNA聚合酶（1U）1μL，模板2μL，雙蒸水補(bǔ)至30μL（總反應(yīng)體系為30?L）。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28個(gè)循環(huán)后于72℃延伸5min[2]。

2.4 電泳鑒定

將PCR產(chǎn)物各取6?L，加2?L 6×loading Buffer，混勻后點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，DNA MarkerⅠ為參照，60V，30min，成像并拍照。

3 結(jié)果

4 討論

線粒體DNA基因組的優(yōu)點(diǎn)很多，比如分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、無(wú)重組、與核DNA基因組無(wú)共同序列、多拷貝、進(jìn)化速率快、分子鐘理論等，和核DNA相比更容易檢測(cè)，親緣關(guān)系相關(guān)或相近的物種都能得到區(qū)分和鑒定。采用mtDNA作為分子標(biāo)記的研究工作已被廣泛地展開(kāi)，而且比同等長(zhǎng)度的核DNA基因研究更為深入?，F(xiàn)在常用的分子標(biāo)記物有Cytb基因、16SrRNA基因、12S rRNA基因、Co基因、D-loop 控制區(qū)、NP基因等，其間Cytb基因由于其獨(dú)具的優(yōu)勢(shì)而廣泛研究應(yīng)用。Cytb起源很古老，發(fā)現(xiàn)于許多原核生物的細(xì)胞和幾乎所有的真核生物中。它不僅在屬間、種間存在多樣性，而且在品種內(nèi)、品種間個(gè)體間都存在多樣性。所以對(duì)闡明生物間的親緣關(guān)系和物種鑒定方面都具有極其重要的意義[3]。Cytb基因和其余線粒體基因比較，進(jìn)化速度適中，容易被一些通用引物擴(kuò)增和測(cè)序，從結(jié)構(gòu)和功能方面看也是當(dāng)前研究最為清楚的基因之一，常用作科以上分類單位和種間的進(jìn)化研究。Cytb基因是線粒體功能區(qū)，在物種進(jìn)化研究中，線粒體功能區(qū)的序列測(cè)定作為重要依據(jù)得到廣泛應(yīng)用。在進(jìn)化過(guò)程中，基因序列變異率相對(duì)較高，種間差異較大，是當(dāng)今脊椎動(dòng)物中被測(cè)序得最廣泛的基因。Cytb基因是研究種間進(jìn)化關(guān)系最好的基因，越來(lái)越廣泛地應(yīng)用，有可能成為分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)片段，在物種鑒定中可將Cytb基因檢測(cè)作為一種重要的手段。

在實(shí)驗(yàn)操作中，我們應(yīng)從反應(yīng)的模板DNA濃度、反應(yīng)體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進(jìn)行反復(fù)摸索，找到反應(yīng)的最佳條件，使反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度重復(fù)性。在進(jìn)行鑒定前，應(yīng)將藥材進(jìn)行徹底清洗后紫外照射30min，避免結(jié)果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來(lái)自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴(kuò)增出306bp基因片段，而牛鞭未擴(kuò)增出相同的基因片段[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用此鹿鞭特異性引物對(duì)市售鹿鞭進(jìn)行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結(jié)果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所的鑒定結(jié)果相符。該結(jié)果表明：本課題組設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結(jié)果來(lái)看，將分子生物學(xué)技術(shù)引入到動(dòng)物類藥材的鑒定中是可行的，說(shuō)明用以上技術(shù)鑒定動(dòng)物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張麗華，李明成，王冰梅，等.貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（22）：1694-1696.

[2] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（2）：30-31.

[3] 李慧珍，李水福.鹿鞭的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（10）：66-69.

[4] 張麗華，李明成，王冰梅.貂組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b鑒定及特征[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，34（5）：790-793.

[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 劉洋，楊明妍，張麗華，等.梅花鹿鞭與偽品牛鞭細(xì)胞色素bDNA指紋鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在實(shí)驗(yàn)操作中，我們應(yīng)從反應(yīng)的模板DNA濃度、反應(yīng)體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進(jìn)行反復(fù)摸索，找到反應(yīng)的最佳條件，使反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度重復(fù)性。在進(jìn)行鑒定前，應(yīng)將藥材進(jìn)行徹底清洗后紫外照射30min，避免結(jié)果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來(lái)自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴(kuò)增出306bp基因片段，而牛鞭未擴(kuò)增出相同的基因片段[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用此鹿鞭特異性引物對(duì)市售鹿鞭進(jìn)行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結(jié)果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所的鑒定結(jié)果相符。該結(jié)果表明：本課題組設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結(jié)果來(lái)看，將分子生物學(xué)技術(shù)引入到動(dòng)物類藥材的鑒定中是可行的，說(shuō)明用以上技術(shù)鑒定動(dòng)物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張麗華，李明成，王冰梅，等.貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（22）：1694-1696.

[2] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（2）：30-31.

[3] 李慧珍，李水福.鹿鞭的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（10）：66-69.

[4] 張麗華，李明成，王冰梅.貂組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b鑒定及特征[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，34（5）：790-793.

[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 劉洋，楊明妍，張麗華，等.梅花鹿鞭與偽品牛鞭細(xì)胞色素bDNA指紋鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在實(shí)驗(yàn)操作中，我們應(yīng)從反應(yīng)的模板DNA濃度、反應(yīng)體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進(jìn)行反復(fù)摸索，找到反應(yīng)的最佳條件，使反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度重復(fù)性。在進(jìn)行鑒定前，應(yīng)將藥材進(jìn)行徹底清洗后紫外照射30min，避免結(jié)果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來(lái)自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴(kuò)增出306bp基因片段，而牛鞭未擴(kuò)增出相同的基因片段[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用此鹿鞭特異性引物對(duì)市售鹿鞭進(jìn)行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結(jié)果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所的鑒定結(jié)果相符。該結(jié)果表明：本課題組設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結(jié)果來(lái)看，將分子生物學(xué)技術(shù)引入到動(dòng)物類藥材的鑒定中是可行的，說(shuō)明用以上技術(shù)鑒定動(dòng)物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張麗華，李明成，王冰梅，等.貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（22）：1694-1696.

[2] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（2）：30-31.

[3] 李慧珍，李水福.鹿鞭的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（10）：66-69.

[4] 張麗華，李明成，王冰梅.貂組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b鑒定及特征[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，34（5）：790-793.

[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 劉洋，楊明妍，張麗華，等.梅花鹿鞭與偽品牛鞭細(xì)胞色素bDNA指紋鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）