強(qiáng) 偉，朱利娜，史俊友，索有瑞

(1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海 西寧 810001； 2.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100049)

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·，Sigma公司)；無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、亞硝酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘己二胺等均為國產(chǎn)市售分析純；精密電子天平、電子恒溫不銹鋼水浴鍋、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、Cary300型紫外可見分光光度計(jì)(美國Varian公司)。

1.2 沙棘果粉的制備

果粉由本課題組提供，生產(chǎn)流程為：原料采收→果汁驗(yàn)收→果汁滅菌→果汁沉降→果汁過濾→果粉噴霧干燥工藝→產(chǎn)品檢驗(yàn)與保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程與方法

1.3.1 沙棘果粉對(duì)DPPH·抑制率測(cè)定[3]

1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或過氧化氫自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。DPPH·有個(gè)單電子，其乙醇水溶液呈紫色，加入受試物后λ 517 nm吸收值下降則表示其對(duì)自由基有消除能力[4]。

精確吸取不同質(zhì)量濃度的沙棘果粉水溶液2 mL，加入4 mL 5×10-5mol/L DPPH·(用無水乙醇溶解)溶液，搖勻后靜置30 min，以樣品溶液做對(duì)照，測(cè)517 nm處的吸光光度值A(chǔ)，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在517 nm處的A0，空白對(duì)照液溶液在517 nm的A1，按下列公式計(jì)算其清除率。

式中，A：樣品加上DPPH·的吸光度；A0：樣品本身的吸光度，以蒸餾水代替顯色劑；A1：空白對(duì)照液，以蒸餾水代替樣品

1.3.2 沙棘果粉對(duì)·OH抑制率的測(cè)定

Feton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，反應(yīng)式為：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+。羥自由基氧化水楊酸得到2,3-二羥基苯甲酸，用其在525 nm處的吸光值表示·OH的多少。吸光值與·OH的量成正比。反應(yīng)體系中加入具有清除·OH作用的物質(zhì)即可降低該吸光值[5]。

水楊酸法：取若干支比色管，依次加入9 mmol/L FeSO40.25 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.25 mL，不同質(zhì)量濃度的沙棘果粉溶液5 mL，最后加8.8 mmol/L H2O20.25 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h，以蒸餾水做空白對(duì)照，525 nm測(cè)A，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在525 nm處的A0，空白對(duì)照液在525 nm的A1，按1.3.1計(jì)算方法計(jì)算清除率。

在25mL的比色管中加入3 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，1 mL不同質(zhì)量濃度的沙棘果粉溶液，25℃±0.5℃水浴平衡20 min后，加入0.3 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，加入1 mL 10 mol/L的HCl終止反應(yīng)，在322 nm處測(cè)A。同時(shí)測(cè)定樣品溶液在322 nm處的A0，空白對(duì)照液在322 nm的A1，按1.3.1計(jì)算方法計(jì)算清除率。

當(dāng)加入沙棘果粉溶液時(shí)，溶液中的有效成分與NaNO2作用將NaNO2消耗掉，剩余亞硝酸根在酸性條件下，能使對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再使其與鹽酸萘己二胺偶合生成紅色偶聯(lián)化合物，測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率[8]。

將0.5 mol/L的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 3.0)5.0 mL置于25 mL比色管中，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的NaNO2溶液，再分別加入10 mL不同濃度的沙棘果粉溶液，定容至刻度。37℃反應(yīng)1 h。取1 mL反應(yīng)液于50 mL容量瓶中，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，0.2%的鹽酸萘己二胺1 mL，搖勻放置15 min后，用分光光度計(jì)在544 nm處測(cè)A，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在544 nm處的A0，空白對(duì)照液在322 nm的A1，按1.3.1計(jì)算方法計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)DPPH·自由基的清除作用

不同濃度沙棘果粉溶液加入到5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液，反應(yīng)30 min后，其清除能力如圖1所示。沙棘果粉對(duì)DPPH·有很好的清除作用，隨著果粉濃度的增大，對(duì)DPPH·的清除作用迅速增強(qiáng)。但當(dāng)果粉用量超過0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除作用變化很小，當(dāng)果粉濃度為0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為96.78%。沙棘果粉清除DPPH·的IC50值為0.22 mg/mL左右。

圖1 沙棘果粉對(duì)DPPH·的清除率

2.2 對(duì)·OH清除作用

羥基自由基(·OH)是最活潑、毒性最大的自由基，它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老，且反應(yīng)速度非?？臁Ｉ臣蹖?duì)·OH的清除效果見圖2。由圖2可知，隨著果粉濃度的增大，清除效果增加，當(dāng)濃度增大為0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率為56.40%，超過此濃度時(shí)，對(duì)·OH清除變化很小。沙棘果粉清除·OH的IC50值為0.72 mg/mL 左右。

圖2 沙棘果粉對(duì)·OH的清除率

2.3 對(duì)堿性鄰苯三酚體系產(chǎn)生的的清除作用

圖3 沙棘果粉對(duì)O2·的清除率

2.4 對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

圖4 沙棘果粉對(duì)亞硝酸鹽的清除率

3 結(jié) 語

參考文獻(xiàn)：

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