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        臭氧后處理對大鼠腎臟缺血/再灌注后Smad-7表達的影響

        2014-03-28 07:35:30劉修恒陳志遠翁小東
        醫(yī)學綜述 2014年15期
        關(guān)鍵詞:后處理腎小管管腔

        王 磊,劉修恒,陳 暉,陳志遠,翁小東,邱 濤,劉 林

        (武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科,武漢 430060)

        腎臟缺血/再灌注損傷(ischemic and reperfusion injury,IRI)是腎缺血組織在得到血液再灌注后發(fā)生的組織細胞損傷加重的一種病理現(xiàn)象,是臨床上不可避免的病理過程之一,有學者認為,腎臟IRI對移植腎功能的影響要大于人類白細胞抗原系統(tǒng)配型不合[1]。研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smads信號轉(zhuǎn)導通路在腎臟中非常重要,而Smad-7作為該通路中的內(nèi)源性抑制因子,發(fā)揮著重要作用[2]。目前,關(guān)于臭氧后處理對大鼠腎臟IRI后Smad-7表達的影響尚無文獻報道。本研究欲探討臭氧后處理對腎臟IRI后Smad-7表達的影響,并進一步探討其作用機制。

        1 材料與方法

        1.1模型的建立與分組 選取由武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供的健康雄性SD大鼠24只,均為8周齡,體質(zhì)量為220~250 g。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為3組,每組8只。假手術(shù)組:腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg),麻醉大鼠,然后游離雙側(cè)腎臟,切除右腎后縫合腹壁。IRI組:在游離雙側(cè)腎臟及切除右腎后,用無創(chuàng)傷血管夾夾閉左腎動、靜脈45 min制造缺血,然后開放血管夾進行再灌注24 h,余同假手術(shù)組。腎臟由暗紅色變成鮮紅色代表再灌注成功。臭氧后處理(ozone postconditioning,OP)組:再灌注后10 d內(nèi),對該組大鼠經(jīng)直腸吹入氧氣和臭氧的混合氣體2.5~3.0 mL[臭氧濃度為50 mg/L,0.5 mg/(kg·d)][3],余同缺血/再灌注組。

        1.2儀器與試劑 YKS-1000臭氧發(fā)生儀購自珠海依科醫(yī)療器械有限公司,Smad-7和β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

        1.3樣本采集和處理

        1.3.1標本采集 分別于IRI 24 h后采集大鼠腹腔靜脈血待測,處死各組大鼠獲取腎臟組織,一部分迅速置于液氮中保存,另一部分用固定液固定后,常規(guī)石蠟包埋。

        1.3.2血清尿素氮和肌酐的檢測 將采集的大鼠血液標本常溫離心,獲取大鼠血清,使用Olympus全自動生化分析儀(Au2700)測定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)水平。

        1.3.3腎組織病理學檢查 取大鼠腎組織,用多聚甲醛固定后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色,之后在400倍光鏡下觀察其病理改變。

        1.3.4蛋白免疫印跡法檢測Smad-7 從-80 ℃冰箱中取出保存后的腎組織,采用BCA(bicinchoninic acid)試劑盒檢測蛋白濃度,取20 μg蛋白上樣,用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜,50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后加入1∶1000稀釋的Smad-7兔抗大鼠多克隆抗體,4 ℃下?lián)u床過夜。之后與辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔抗體(1∶2000稀釋)結(jié)合,洗膜后化學發(fā)光法顯色、照相,并作灰度值分析。

        2 結(jié) 果

        2.1各組大鼠血清Cr和BUN水平的比較 假手術(shù)組相比,IRI組的Cr、BUN水平顯著增高;而與IRI組相比,OP組BUN和Cr顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

        2.2各組大鼠腎組織學觀察結(jié)果 光鏡下可見假手術(shù)組的大鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變不明顯。而IRI組可見腎小管上皮細胞刷狀緣消失,上皮細胞變性、壞死明顯,腎小管腔明顯擴張,管腔內(nèi)可見管型。OP組可見上皮細胞扁平,僅部分刷狀緣消失,部分管腔明顯擴張,偶見管型,與IRI組相比組織病理學改變明顯減輕。

        表1 各組大鼠血清Cr、BUN水平的比較

        圖1-1 假手術(shù)組 圖1-2 缺血/再灌注組 圖1-3 臭氧后處理組

        2.3各組大鼠腎組織Smad-7表達的比較 根據(jù)灰度值分析可知,與假手術(shù)組相比,IRI組Smad-7的表達量顯著降低;而與IRI組相比,OP組中Smad-7的表達明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

        圖2-1 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示Smad-7的表達水平

        圖2-2 Smad-7與內(nèi)參的相對比值

        3 討 論

        臭氧的醫(yī)療用途開始于外科創(chuàng)傷治療,其機制主要是廣譜殺菌、抗炎、促成局部組織再生,隨后,臭氧的醫(yī)療用途逐步涉及到心血管、內(nèi)分泌、腫瘤等多個臨床科室[4]。在腎移植中,IRI是影響移植腎存活率的重要因素之一,尤其在再灌注后產(chǎn)生大量的活性氧,會導致細胞凋亡,進一步加重損害[5]。目前關(guān)于臭氧對IRI保護作用的報道較多,但都集中于預處理,本團隊的前期研究也已經(jīng)證實,臭氧預處理能夠保護大鼠腎臟IRI,其機制與減輕脂質(zhì)過氧化反應、減少炎性因子合成有關(guān)[6]。雖然該方法具有保護作用,但在實際臨床工作中,由于組織器官發(fā)生缺血的不可預見性,使得臭氧預處理的應用受到了很大的限制,而臭氧后處理可以克服這個困難。Smads蛋白是在細胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導的一類蛋白質(zhì),在新近的研究中發(fā)現(xiàn)其是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路的下游調(diào)節(jié)因子,其中Smad-7是該信號通路中最重要的抑制因子[7],對細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有積極作用。有研究發(fā)現(xiàn),TGF-β誘導腎小管上皮細胞的生長停滯、凋亡以及間質(zhì)纖維化,與其細胞內(nèi)Smad-7負調(diào)控作用的不足有關(guān)[8]。但也有研究表明該負調(diào)控作用有缺點,當缺乏配體時,Smad-7主要位于核內(nèi),而有配體存在時,Smad-7需轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中才能與受體結(jié)合發(fā)揮作用,但該調(diào)控機制反應較慢,因此有學者建議將外源性Smad-7基因轉(zhuǎn)到培養(yǎng)的腎小管細胞中,來拮抗TGF-B1誘導的G1停滯,減低細胞凋亡。目前對于Smad-7在大鼠腎臟IRI后的表達情況少有報道。本研究欲觀察臭氧后處理對大鼠腎臟IRI損傷后Smad-7表達情況的影響,并對其保護機制作進一步探討。

        腎臟IRI損傷的機制至今尚未完全闡明,主要學說包括氧自由基作用、白細胞作用、鈣超載、活性因子作用等方面。據(jù)文獻報道,移植腎臟缺血/再灌注后引起的腎細胞凋亡是IRI的重要原因[9],在本實驗中,與假手術(shù)組相比,IRI組和OP組的Cr、BUN水平均顯著升高,而OP組能夠明顯減輕因IRI導致的Cr、BUN的上升,差異有統(tǒng)計學意義,說明臭氧后處理可以改善腎功能。組織病理學檢查結(jié)果也提示,假手術(shù)組無明顯改變;IRI組可見腎小管上皮細胞刷狀緣消失,上皮細胞變性、壞死明顯,腎小管腔明顯擴張,管腔內(nèi)可見管型。而OP組與IRI組相比組織病理學改變明顯減輕,可見上皮細胞扁平,僅部分刷狀緣消失,部分管腔明顯擴張,偶見管型。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示,假手術(shù)組相比,IRI組的Smad-7的表達量明顯降低;而OP組可以明顯上調(diào)Smad-7的表達量,差異有統(tǒng)計學意義。

        本研究結(jié)果證明了臭氧后處理能明顯提高腎臟缺血/再灌注組織中Smad-7的表達,來發(fā)揮腎臟保護作用,但是對于臭氧后處理通過什么途徑上調(diào)Smad-7的表達、是否與TGF-β1有關(guān),需要在今后的研究中進一步證實。

        [1] Tuuminen R,Syrjala S,Krebs R,etal.Donor simvastatin treatment abolishes rat cardiac allograft ischemia/reperfusion injury and chronic rejection through microvascular protection[J].Circulation,2011,124(10):1138-1150.

        [2] Raju R,Jian B,Hooks JJ,etal.Transforming growth factor-beta regulates the expression of anosmin(KAL-1) in human retinal pigment epithelial cells[J].Cytokine,2013,61(3):724-727.

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