張 偉，胡新德，王久濤，宋玲珍，李玲玲，陳樹林，趙善廷

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

細胞骨架是位于細胞內的一種纖維狀蛋白，由微絲、微管及中間絲組成，三者高度協(xié)調分布，與細胞的形態(tài)特點、能動性、細胞分裂及細胞內小泡和細胞器的運輸?shù)壬砘顒用芮邢嚓P。由于中間纖維相對微管、微絲較為穩(wěn)定，本研究以相對活躍的微管、微絲及其黏著斑為重點，詳細比較了CHO和HEK293T細胞系的整體形態(tài)特點、細胞骨架的差異及其相互間的關系，以期為闡明其適用性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

胎牛血清購自Hyclone公司，D-MEM/F-12、Opti-MEM購自Gibco公司，mouse anti-Vinculin antibody、TRITC-conjugated phalloidin和DAPI均購自Millipore,mouse anti-α-Tubulin antibody購自Sigma公司，mouse anti-β-Actin antibody (C4)購自Santa cruz biotechnology,LipofectamineTM2000和goat anti-mouse IgG Alexa 488購自Invitrogen 公司，goat anti-mouse IgG (HRP Conjugated)購自康為世紀,倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1購自蔡司公司，CHO細胞系、HEK293T細胞系、pCAG-EGFP質粒由西北農(nóng)林科技大學神經(jīng)生物學研究室保存。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

CHO和HEK293T細胞在富含體積分數(shù)10%胎牛血清和青鏈霉素(100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素)的DMEM/F12(體積比1∶1)培養(yǎng)基中生長，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到80%時，用質量分數(shù)0.25%的胰酶消化并1∶10傳代，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。細胞轉染參照LipofectamineTM2000的使用說明進行。

1.3 CHO和HEK293T細胞骨架的比較

1.3.1 細胞骨架的形態(tài)觀察 待爬片上的細胞長至25%～40%時，經(jīng)質量分數(shù)4%多聚甲醛固定、體積分數(shù)0.1% Triton X-100透化，用體積分數(shù)1%的正常羊血清封閉，中間漂洗用0.1 mol/L PBS。PBS漂洗后的爬片，在體積比為1∶1 000的mouse anti-Vinculin antibody 中4 ℃過夜孵育，用于標記黏著斑；或在體積比為1∶1 000的mouse anti-α-Tubulin antibody中4 ℃過夜孵育，用于標記微管。再用PBS漂洗后，用體積比為1∶300的goat anti-mouse IgG Alexa 488室溫孵育2 h；漂洗后，再在體積比為1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin 中室溫孵育2 h，用于標記微絲；經(jīng)PBS漂洗，用體積比為1∶500的DAPI復染2 min標記細胞核。用抗熒光萃滅劑(Dako)封漂洗后的爬片，置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1下觀察拍照。

1.3.2 核質比測量 將爬片上的細胞置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1 63X鏡下觀察，用體積比為1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin標記細胞輪廓，體積比為1∶500的DAPI復染細胞核。分別選取合適的細胞40個，若該細胞核是圓形，直接測量細胞核直徑；若該細胞核是橢圓形，測量其長直徑。再從中選取30個細胞測量細胞及細胞核直徑c或長短直徑a和b，測量軟件為Axio Observer Z1自帶。計算細胞及細胞核體積，公式如下：圓形V=4/3×π×(c/2)3，橢圓形V=4/3×π×(a/2)×(b/2)2；核質比N/D=Vn/(Vc-Vn)(式中，Vn是細胞核體積，Vc是細胞體積)。

1.4 CHO和HEK293T細胞遷移特性的比較

1.4.1 細胞的活動能力 綠色熒光蛋白(GFP)在細胞中彌散分布，可有效標記出細胞的整體輪廓，展示細胞骨架的動態(tài)變化。待培養(yǎng)皿中的細胞長至60%～70%時，利用LipofectamineTM2000轉染pCAG-EGFP質粒標記待觀察細胞，24 h后置于活細胞工作站借助蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1實時動態(tài)觀察細胞變化。隨機選取轉染后顯綠色熒光蛋白的陽性細胞，每隔6 min自動拍攝一張照片，共19 min。細胞核光透射率低，被轉染細胞光密度最大處即為細胞核位置，以星號表示。

1.4.2 細胞的遷移能力 細胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達90%以上時，用Eppendorf黃色吸頭沿培養(yǎng)皿直徑劃一條直線，并用PBS沖洗凈直線上的細胞，換用DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1下，隨機選取4個視野于鏡下觀察并拍照，并對觀察視野做好標記。然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后取出于顯微鏡下再次觀察同樣的視野。利用Axio Observer Z1顯微鏡自帶軟件對遷移前后的距離進行測量。遷移距離以遷移前后特定位置劃痕兩邊界距離的差值計算。

1.5 α-Tubulin和β-Actin蛋白表達的免疫印跡分析

用直徑60 mm培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)CHO和HEK293T細胞，待細胞融合度達90%以上時，倒掉細胞培養(yǎng)液，PBS漂洗后，直接用細胞刮鏟收集細胞，并以組織細胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,體積分數(shù)1% Triton X-100,質量分數(shù)1% Sodium Deoxycholate,質量分數(shù)0.1% SDS,Sodium Orthovanadate,Sodium Fluoride,EDTA 和 1 mmol/L PMSF)裂解細胞，收集裂解物。變性后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，以預染的蛋白Marker為標記，切取目的條帶凝膠。以質量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉含目的條帶的PVDF膜，經(jīng)封閉液1∶1 000(體積比)稀釋的mouse anti-β-Actin antibody (C4)和mouse anti-α-Tubulin antibody 4 ℃過夜孵育后，以HRP偶聯(lián)的1∶2 000(體積比)goat anti-mouse IgG室溫孵育2 h。利用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測免疫印跡蛋白條帶，并用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，測出條帶整合光密度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗中采取3個獨立重復對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以“平均值+標準差”表示。2組數(shù)據(jù)間比較用GraphPad Prism v5.0軟件進行t檢測，以P<0.05記為“*”，P<0.01記為“**”，P<0.001記為“***”。

完成這次采訪任務可不簡單，“一個人就像一支隊伍”，一下子采訪了這么多藝術家和小演員，實在是又忙又歡樂。我真切地感受到一場跨國演出幕后的艱辛，大人與孩子們之間互相尊重、彼此信任是多么重要呀！

2 結果與分析

2.1 CHO和HEK293T細胞形態(tài)及其細胞骨架特點

CHO細胞呈不規(guī)則形，胞體較大，胞漿豐富，輪廓清楚(圖1)；細胞核卵圓形，位于胞質中央，細胞密集時呈長梭形，無偽足或偽足較少，細胞稀疏時伸出偽足(圖1)。HEK293T細胞也呈不規(guī)則形，胞體較小，有圓形或橢圓形的核(圖2)。細胞之間通過刷緣狀的微絨毛及偽足連接，呈鋪路石樣鑲嵌排列(圖2)。

圖 1 CHO細胞中微絲、微管及黏著斑的免疫熒光分析

圖 2 HEK293T細胞中微絲、微管及黏著斑的免疫熒光分析

CHO與HEK293T細胞核直徑無明顯差別(圖3-A)，但核質比為HEK293T大于CHO細胞，且差異極顯著(圖3-B)。

圖 3 CHO和HEK293T細胞核直徑與核質比的比較

CHO細胞經(jīng)TRITC-conjugated phalloidin標記的肌動蛋白微絲(F-actin)位于細胞質及偽足中，平行排列的應力纖維終止于細胞邊緣 (圖1-A,白色箭頭)；微管組織中心(MTOC)發(fā)出大量微管散向四周(圖1-B)，和微絲一起構成了CHO細胞的主要骨架網(wǎng)絡；同時，細胞表面有很多長短不一的偽足出現(xiàn)(圖1-A和B)。HEK293T細胞的F-actin富集于細胞周邊，而黏著斑彌散分布(圖2-A)；微管高度密集分布于細胞邊緣圍繞著細胞核，部分微管進入片狀偽足中(圖2-B,白色短箭頭)；細胞表面存在偽足和微絨毛(圖2)。

2.2 CHO與HEK293T細胞活動能力的比較

CHO細胞突起變化明顯，生長錐持續(xù)性改變(圖4中標白色箭頭處)；1 min時細胞一端有生長錐，隨后生長錐快速消失，細胞核位置隨著生長錐的變化也在改變(圖4標“*”處)，并且胞體和尾部有收縮現(xiàn)象(圖4)。HEK293T細胞突起也有變化，19 min內在細胞主突起分支上又產(chǎn)生新的突起，并且繼續(xù)有胞內成分向突起處轉運聚集(圖4中標白色箭頭處)，但速度較慢且短時間內細胞核位置相對穩(wěn)定(圖4標“*”處)。由此可知，CHO細胞的活動能力較HEK293T細胞強。

圖 4 CHO和HEK293T綠色熒光蛋白陽性遷移細胞的延時成像分析

2.3 CHO與HEK293T細胞遷移能力的比較

為進一步比較CHO和HEK293T細胞的遷移能力，采用劃痕試驗在48 h內對2種細胞的遷移速度進行定量。結果(圖5)顯示，CHO劃痕后0 h邊緣平整，間隙很大；48 h后大量邊緣細胞占據(jù)劃痕很大區(qū)域，并且細胞呈現(xiàn)向內繼續(xù)運動的趨勢。HEK293T細胞劃痕48 h前后變化不大，僅占據(jù)劃痕很少區(qū)域，且邊緣細胞向內運動趨勢不明顯。2種細胞均有一定的運動能力，但CHO細胞的運動能力更強，其細胞遷移速度約是HEK293T的2.9倍，二者差異極顯著(P<0.001)。

圖 5 CHO和HEK293T細胞的遷移速度(A)及遷移距離(B)比較

2.4 CHO與HEK293T細胞骨架結構基因的表達差異

人與小鼠基因有高度的同源性，本研究發(fā)現(xiàn)，人與小鼠結構基因微管組成成分α-Tubulin的氨基酸同源性為96.84%，微絲組成成分β-Actin的氨基酸同源性高達100%。遺傳信息的高度一致性決定了其功能的一致性，但是本研究發(fā)現(xiàn)，CHO和HEK293T細胞中微管、微絲的基本結構組分α-Tubulin和β-Actin的相對含量存在很大差別(圖6)，CHO細胞中二者光密度比值是HEK293T中的1.2倍。

圖 6 CHO、HEK293T細胞中α-Tubulin和β-Actin蛋白的表達差異

3 討 論

細胞運動依賴于細胞偽足在細胞前沿的聚合，前端偽足與基質結合提供拉動胞體前進的動力，同時還依賴于胞體和尾部的收縮[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHO細胞中有應力纖維，而應力纖維主要存在于靜態(tài)的細胞中[7]， 抑制細胞遷移[8]。有報道稱，靜態(tài)細胞微管延伸至細胞邊緣，動態(tài)細胞如黑素瘤細胞在前進的片狀偽足中極少有微管[9-10]。本實驗中，CHO細胞微管發(fā)散至周邊，少數(shù)進入偽足;而在HEK293T中微管富集在細胞周邊，多數(shù)進入偽足；同時，延時成像和劃痕試驗證實，2種細胞系均具有動態(tài)性，但CHO細胞的運動能力更強。綜上所述，CHO細胞雖比HEK293T細胞運動能力強，但受細胞骨架結構的影響，CHO細胞屬于有輕微運動能力的細胞。

細胞核和細胞質是細胞分化的內在因素，細胞核提供特異的mRNA及其他核酸分子的合成模板，而細胞質中的核蛋白體含有幾乎全部蛋白質合成所需要的成分，細胞質對基因的表達起調節(jié)作用。本研究通過對CHO和HEK293T細胞的細胞核直徑和核質比的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CHO細胞核體積與HEK293T細胞核相似，而CHO細胞的核質比小于HEK293T細胞，預示著2種細胞基因存在著選擇性表達，這與2種細胞系α-Tubulin/β-Actin蛋白相對含量存在很大差別一致。

CHO與HEK293T細胞在細胞形態(tài)、遷移方面的差異除受微管、微絲相對含量及其分布的影響外，還取決于微管、微絲間的相互作用。Vasiliev等[11]發(fā)現(xiàn)，在運動的纖維母細胞前沿，完整的微管骨架可以維持肌動蛋白依賴的突起的極性分布，這種互作的細胞分子基礎是“張拉整體模型”[12-13]。微管、微絲的互作方式有2種：一種是通過信號級聯(lián)反應相互影響，另一種是結構上的直接作用[14]。微管、微絲通過信號級聯(lián)反應相互影響最典型的例子是，小G蛋白中的Rho家族成員作為中間媒介實現(xiàn)微管、微絲的相互影響[15]；如RhoA介導肌動蛋白應力纖維的組裝[16]，同時促使局部微管的穩(wěn)定[17]；同樣，Rac1可調節(jié)微絲、微管的聚合，促進偽足突起的形成[18-19]；且Rho的活性也可被微管、微絲調控，微管或微絲的分解可激活RhoA[20]，而微管的組裝可促進Rac1的活性[21]。對于微管、微絲結構上的直接互作，有研究在非洲爪蛙卵提取物中觀察到了微管、微絲在靜態(tài)和動態(tài)下的相互作用[22]：靜態(tài)下的相互作用可由微管、微絲結合蛋白復合體或單個同時結合2種結構的蛋白介導，而動態(tài)下的相互作用可能涉及微管或微絲依賴的動力蛋白和微管或微絲的結合蛋白，亦或是復合體。

本研究從CHO和HEK293T細胞的形態(tài)和遷移特性著手，對比描述了二者的細胞骨架結構和運動特點，加深了對2種細胞系的認識。結果顯示，CHO與HEK293T細胞相比，細胞骨架活動性強，遷移速度快且結構清晰。因此，CHO細胞可用于細胞骨架形態(tài)研究和對細胞遷移能力影響的模擬試驗，而HEK293T細胞不適于此類研究。

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