張 偉，胡新德，王久濤，宋玲珍，李玲玲，陳樹林，趙善廷

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

細(xì)胞骨架是位于細(xì)胞內(nèi)的一種纖維狀蛋白，由微絲、微管及中間絲組成，三者高度協(xié)調(diào)分布，與細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)、能動(dòng)性、細(xì)胞分裂及細(xì)胞內(nèi)小泡和細(xì)胞器的運(yùn)輸?shù)壬砘顒?dòng)密切相關(guān)。由于中間纖維相對(duì)微管、微絲較為穩(wěn)定，本研究以相對(duì)活躍的微管、微絲及其黏著斑為重點(diǎn)，詳細(xì)比較了CHO和HEK293T細(xì)胞系的整體形態(tài)特點(diǎn)、細(xì)胞骨架的差異及其相互間的關(guān)系，以期為闡明其適用性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

胎牛血清購自Hyclone公司，D-MEM/F-12、Opti-MEM購自Gibco公司，mouse anti-Vinculin antibody、TRITC-conjugated phalloidin和DAPI均購自Millipore,mouse anti-α-Tubulin antibody購自Sigma公司，mouse anti-β-Actin antibody (C4)購自Santa cruz biotechnology,LipofectamineTM2000和goat anti-mouse IgG Alexa 488購自Invitrogen 公司，goat anti-mouse IgG (HRP Conjugated)購自康為世紀(jì),倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1購自蔡司公司，CHO細(xì)胞系、HEK293T細(xì)胞系、pCAG-EGFP質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

CHO和HEK293T細(xì)胞在富含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青鏈霉素(100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素)的DMEM/F12(體積比1∶1)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化并1∶10傳代，以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000的使用說明進(jìn)行。

1.3 CHO和HEK293T細(xì)胞骨架的比較

1.3.1 細(xì)胞骨架的形態(tài)觀察 待爬片上的細(xì)胞長(zhǎng)至25%～40%時(shí)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100透化，用體積分?jǐn)?shù)1%的正常羊血清封閉，中間漂洗用0.1 mol/L PBS。PBS漂洗后的爬片，在體積比為1∶1 000的mouse anti-Vinculin antibody 中4 ℃過夜孵育，用于標(biāo)記黏著斑；或在體積比為1∶1 000的mouse anti-α-Tubulin antibody中4 ℃過夜孵育，用于標(biāo)記微管。再用PBS漂洗后，用體積比為1∶300的goat anti-mouse IgG Alexa 488室溫孵育2 h；漂洗后，再在體積比為1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin 中室溫孵育2 h，用于標(biāo)記微絲；經(jīng)PBS漂洗，用體積比為1∶500的DAPI復(fù)染2 min標(biāo)記細(xì)胞核。用抗熒光萃滅劑(Dako)封漂洗后的爬片，置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1下觀察拍照。

1.3.2 核質(zhì)比測(cè)量 將爬片上的細(xì)胞置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1 63X鏡下觀察，用體積比為1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin標(biāo)記細(xì)胞輪廓，體積比為1∶500的DAPI復(fù)染細(xì)胞核。分別選取合適的細(xì)胞40個(gè)，若該細(xì)胞核是圓形，直接測(cè)量細(xì)胞核直徑；若該細(xì)胞核是橢圓形，測(cè)量其長(zhǎng)直徑。再從中選取30個(gè)細(xì)胞測(cè)量細(xì)胞及細(xì)胞核直徑c或長(zhǎng)短直徑a和b，測(cè)量軟件為Axio Observer Z1自帶。計(jì)算細(xì)胞及細(xì)胞核體積，公式如下：圓形V=4/3×π×(c/2)3，橢圓形V=4/3×π×(a/2)×(b/2)2；核質(zhì)比N/D=Vn/(Vc-Vn)(式中，Vn是細(xì)胞核體積，Vc是細(xì)胞體積)。

1.4 CHO和HEK293T細(xì)胞遷移特性的比較

1.4.1 細(xì)胞的活動(dòng)能力 綠色熒光蛋白(GFP)在細(xì)胞中彌散分布，可有效標(biāo)記出細(xì)胞的整體輪廓，展示細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pCAG-EGFP質(zhì)粒標(biāo)記待觀察細(xì)胞，24 h后置于活細(xì)胞工作站借助蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞變化。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)染后顯綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞，每隔6 min自動(dòng)拍攝一張照片，共19 min。細(xì)胞核光透射率低，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞光密度最大處即為細(xì)胞核位置，以星號(hào)表示。

1.4.2 細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，用Eppendorf黃色吸頭沿培養(yǎng)皿直徑劃一條直線，并用PBS沖洗凈直線上的細(xì)胞，換用DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于蔡司倒置熒光顯微鏡Axio Observer Z1下，隨機(jī)選取4個(gè)視野于鏡下觀察并拍照，并對(duì)觀察視野做好標(biāo)記。然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后取出于顯微鏡下再次觀察同樣的視野。利用Axio Observer Z1顯微鏡自帶軟件對(duì)遷移前后的距離進(jìn)行測(cè)量。遷移距離以遷移前后特定位置劃痕兩邊界距離的差值計(jì)算。

1.5 α-Tubulin和β-Actin蛋白表達(dá)的免疫印跡分析

用直徑60 mm培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)CHO和HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗后，直接用細(xì)胞刮鏟收集細(xì)胞，并以組織細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100,質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% Sodium Deoxycholate,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS,Sodium Orthovanadate,Sodium Fluoride,EDTA 和 1 mmol/L PMSF)裂解細(xì)胞，收集裂解物。變性后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，以預(yù)染的蛋白Marker為標(biāo)記，切取目的條帶凝膠。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉含目的條帶的PVDF膜，經(jīng)封閉液1∶1 000(體積比)稀釋的mouse anti-β-Actin antibody (C4)和mouse anti-α-Tubulin antibody 4 ℃過夜孵育后，以HRP偶聯(lián)的1∶2 000(體積比)goat anti-mouse IgG室溫孵育2 h。利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)免疫印跡蛋白條帶，并用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，測(cè)出條帶整合光密度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)中采取3個(gè)獨(dú)立重復(fù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示。2組數(shù)據(jù)間比較用GraphPad Prism v5.0軟件進(jìn)行t檢測(cè)，以P<0.05記為“*”，P<0.01記為“**”，P<0.001記為“***”。

完成這次采訪任務(wù)可不簡(jiǎn)單，“一個(gè)人就像一支隊(duì)伍”，一下子采訪了這么多藝術(shù)家和小演員，實(shí)在是又忙又歡樂。我真切地感受到一場(chǎng)跨國演出幕后的艱辛，大人與孩子們之間互相尊重、彼此信任是多么重要呀！

2 結(jié)果與分析

2.1 CHO和HEK293T細(xì)胞形態(tài)及其細(xì)胞骨架特點(diǎn)

CHO細(xì)胞呈不規(guī)則形，胞體較大，胞漿豐富，輪廓清楚(圖1)；細(xì)胞核卵圓形，位于胞質(zhì)中央，細(xì)胞密集時(shí)呈長(zhǎng)梭形，無偽足或偽足較少，細(xì)胞稀疏時(shí)伸出偽足(圖1)。HEK293T細(xì)胞也呈不規(guī)則形，胞體較小，有圓形或橢圓形的核(圖2)。細(xì)胞之間通過刷緣狀的微絨毛及偽足連接，呈鋪路石樣鑲嵌排列(圖2)。

圖 1 CHO細(xì)胞中微絲、微管及黏著斑的免疫熒光分析

圖 2 HEK293T細(xì)胞中微絲、微管及黏著斑的免疫熒光分析

CHO與HEK293T細(xì)胞核直徑無明顯差別(圖3-A)，但核質(zhì)比為HEK293T大于CHO細(xì)胞，且差異極顯著(圖3-B)。

圖 3 CHO和HEK293T細(xì)胞核直徑與核質(zhì)比的比較

CHO細(xì)胞經(jīng)TRITC-conjugated phalloidin標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白微絲(F-actin)位于細(xì)胞質(zhì)及偽足中，平行排列的應(yīng)力纖維終止于細(xì)胞邊緣 (圖1-A,白色箭頭)；微管組織中心(MTOC)發(fā)出大量微管散向四周(圖1-B)，和微絲一起構(gòu)成了CHO細(xì)胞的主要骨架網(wǎng)絡(luò)；同時(shí)，細(xì)胞表面有很多長(zhǎng)短不一的偽足出現(xiàn)(圖1-A和B)。HEK293T細(xì)胞的F-actin富集于細(xì)胞周邊，而黏著斑彌散分布(圖2-A)；微管高度密集分布于細(xì)胞邊緣圍繞著細(xì)胞核，部分微管進(jìn)入片狀偽足中(圖2-B,白色短箭頭)；細(xì)胞表面存在偽足和微絨毛(圖2)。

2.2 CHO與HEK293T細(xì)胞活動(dòng)能力的比較

CHO細(xì)胞突起變化明顯，生長(zhǎng)錐持續(xù)性改變(圖4中標(biāo)白色箭頭處)；1 min時(shí)細(xì)胞一端有生長(zhǎng)錐，隨后生長(zhǎng)錐快速消失，細(xì)胞核位置隨著生長(zhǎng)錐的變化也在改變(圖4標(biāo)“*”處)，并且胞體和尾部有收縮現(xiàn)象(圖4)。HEK293T細(xì)胞突起也有變化，19 min內(nèi)在細(xì)胞主突起分支上又產(chǎn)生新的突起，并且繼續(xù)有胞內(nèi)成分向突起處轉(zhuǎn)運(yùn)聚集(圖4中標(biāo)白色箭頭處)，但速度較慢且短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞核位置相對(duì)穩(wěn)定(圖4標(biāo)“*”處)。由此可知，CHO細(xì)胞的活動(dòng)能力較HEK293T細(xì)胞強(qiáng)。

圖 4 CHO和HEK293T綠色熒光蛋白陽性遷移細(xì)胞的延時(shí)成像分析

2.3 CHO與HEK293T細(xì)胞遷移能力的比較

為進(jìn)一步比較CHO和HEK293T細(xì)胞的遷移能力，采用劃痕試驗(yàn)在48 h內(nèi)對(duì)2種細(xì)胞的遷移速度進(jìn)行定量。結(jié)果(圖5)顯示，CHO劃痕后0 h邊緣平整，間隙很大；48 h后大量邊緣細(xì)胞占據(jù)劃痕很大區(qū)域，并且細(xì)胞呈現(xiàn)向內(nèi)繼續(xù)運(yùn)動(dòng)的趨勢(shì)。HEK293T細(xì)胞劃痕48 h前后變化不大，僅占據(jù)劃痕很少區(qū)域，且邊緣細(xì)胞向內(nèi)運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)不明顯。2種細(xì)胞均有一定的運(yùn)動(dòng)能力，但CHO細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)，其細(xì)胞遷移速度約是HEK293T的2.9倍，二者差異極顯著(P<0.001)。

圖 5 CHO和HEK293T細(xì)胞的遷移速度(A)及遷移距離(B)比較

2.4 CHO與HEK293T細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)差異

人與小鼠基因有高度的同源性，本研究發(fā)現(xiàn)，人與小鼠結(jié)構(gòu)基因微管組成成分α-Tubulin的氨基酸同源性為96.84%，微絲組成成分β-Actin的氨基酸同源性高達(dá)100%。遺傳信息的高度一致性決定了其功能的一致性，但是本研究發(fā)現(xiàn)，CHO和HEK293T細(xì)胞中微管、微絲的基本結(jié)構(gòu)組分α-Tubulin和β-Actin的相對(duì)含量存在很大差別(圖6)，CHO細(xì)胞中二者光密度比值是HEK293T中的1.2倍。

圖 6 CHO、HEK293T細(xì)胞中α-Tubulin和β-Actin蛋白的表達(dá)差異

3 討 論

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)依賴于細(xì)胞偽足在細(xì)胞前沿的聚合，前端偽足與基質(zhì)結(jié)合提供拉動(dòng)胞體前進(jìn)的動(dòng)力，同時(shí)還依賴于胞體和尾部的收縮[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHO細(xì)胞中有應(yīng)力纖維，而應(yīng)力纖維主要存在于靜態(tài)的細(xì)胞中[7]， 抑制細(xì)胞遷移[8]。有報(bào)道稱，靜態(tài)細(xì)胞微管延伸至細(xì)胞邊緣，動(dòng)態(tài)細(xì)胞如黑素瘤細(xì)胞在前進(jìn)的片狀偽足中極少有微管[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，CHO細(xì)胞微管發(fā)散至周邊，少數(shù)進(jìn)入偽足;而在HEK293T中微管富集在細(xì)胞周邊，多數(shù)進(jìn)入偽足；同時(shí)，延時(shí)成像和劃痕試驗(yàn)證實(shí)，2種細(xì)胞系均具有動(dòng)態(tài)性，但CHO細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)。綜上所述，CHO細(xì)胞雖比HEK293T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)，但受細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響，CHO細(xì)胞屬于有輕微運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)胞。

細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞分化的內(nèi)在因素，細(xì)胞核提供特異的mRNA及其他核酸分子的合成模板，而細(xì)胞質(zhì)中的核蛋白體含有幾乎全部蛋白質(zhì)合成所需要的成分，細(xì)胞質(zhì)對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。本研究通過對(duì)CHO和HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞核直徑和核質(zhì)比的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CHO細(xì)胞核體積與HEK293T細(xì)胞核相似，而CHO細(xì)胞的核質(zhì)比小于HEK293T細(xì)胞，預(yù)示著2種細(xì)胞基因存在著選擇性表達(dá)，這與2種細(xì)胞系α-Tubulin/β-Actin蛋白相對(duì)含量存在很大差別一致。

CHO與HEK293T細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、遷移方面的差異除受微管、微絲相對(duì)含量及其分布的影響外，還取決于微管、微絲間的相互作用。Vasiliev等[11]發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)的纖維母細(xì)胞前沿，完整的微管骨架可以維持肌動(dòng)蛋白依賴的突起的極性分布，這種互作的細(xì)胞分子基礎(chǔ)是“張拉整體模型”[12-13]。微管、微絲的互作方式有2種：一種是通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相互影響，另一種是結(jié)構(gòu)上的直接作用[14]。微管、微絲通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相互影響最典型的例子是，小G蛋白中的Rho家族成員作為中間媒介實(shí)現(xiàn)微管、微絲的相互影響[15]；如RhoA介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的組裝[16]，同時(shí)促使局部微管的穩(wěn)定[17]；同樣，Rac1可調(diào)節(jié)微絲、微管的聚合，促進(jìn)偽足突起的形成[18-19]；且Rho的活性也可被微管、微絲調(diào)控，微管或微絲的分解可激活RhoA[20]，而微管的組裝可促進(jìn)Rac1的活性[21]。對(duì)于微管、微絲結(jié)構(gòu)上的直接互作，有研究在非洲爪蛙卵提取物中觀察到了微管、微絲在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)下的相互作用[22]：靜態(tài)下的相互作用可由微管、微絲結(jié)合蛋白復(fù)合體或單個(gè)同時(shí)結(jié)合2種結(jié)構(gòu)的蛋白介導(dǎo)，而動(dòng)態(tài)下的相互作用可能涉及微管或微絲依賴的動(dòng)力蛋白和微管或微絲的結(jié)合蛋白，亦或是復(fù)合體。

本研究從CHO和HEK293T細(xì)胞的形態(tài)和遷移特性著手，對(duì)比描述了二者的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)，加深了對(duì)2種細(xì)胞系的認(rèn)識(shí)。結(jié)果顯示，CHO與HEK293T細(xì)胞相比，細(xì)胞骨架活動(dòng)性強(qiáng)，遷移速度快且結(jié)構(gòu)清晰。因此，CHO細(xì)胞可用于細(xì)胞骨架形態(tài)研究和對(duì)細(xì)胞遷移能力影響的模擬試驗(yàn)，而HEK293T細(xì)胞不適于此類研究。

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