萬(wàn)旭花,陳書(shū)霞,申曉青,陳為峰,張然然,成思瓊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

黃瓜(CucumissativusL.)為葫蘆科黃瓜屬1年生草本植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療作用，尤其是具有獨(dú)特的清香風(fēng)味，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。在長(zhǎng)期的定向選擇和育種實(shí)踐中，人們傾向于選擇抗病優(yōu)質(zhì)的黃瓜品種，這造成黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此常規(guī)育種的發(fā)展面臨著桎梏。利用基因工程進(jìn)行黃瓜新種質(zhì)創(chuàng)制已成為重要的手段之一[1-2]，其中通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行新種質(zhì)創(chuàng)制的前提是建立黃瓜的高頻再生體系[3-4]。

關(guān)于黃瓜離體再生已有許多報(bào)道。前人從不同外植體類型如子葉[5-6]、子葉節(jié)[7-8]、下胚軸[9]、真葉[10]，不同的激素組合[11-14]和苗齡[15-16]等方面，研究了不同因素對(duì)黃瓜再生體系建立的影響，結(jié)果表明，不同基因型黃瓜適宜的激素組合及濃度不同[13-17]，子葉切割及接種方式會(huì)對(duì)黃瓜再生效率產(chǎn)生重要影響[7-8]，由此可見(jiàn)，不同因素對(duì)再生頻率的影響很大[17-20]。在具體實(shí)踐中，仍存在黃瓜再生率較低、重復(fù)性差、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，在實(shí)際操作中，需要進(jìn)一步對(duì)上述影響因素進(jìn)行優(yōu)化和探索。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)影響歐洲型黃瓜和華北型黃瓜種質(zhì)再生體系的因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期為黃瓜種質(zhì)的遺傳轉(zhuǎn)化奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

華北型黃瓜26號(hào)種質(zhì)、歐洲型黃瓜14-1種質(zhì)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 方 法

試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 黃瓜無(wú)菌苗的獲得 挑選顆粒飽滿一致的黃瓜種子，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒90 s，再用體積分?jǐn)?shù)30%的次氯酸鈉消毒25 min，期間不斷搖動(dòng)，消毒后用無(wú)菌水沖洗4～5次，無(wú)菌濾紙吸干水分后，接種于裝有MS 培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種8粒種子，遮光培養(yǎng)2～3 d后，置于室溫22～25 ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)5 d，即可獲得無(wú)菌苗。

1.2.2 黃瓜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)和IAA(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L)，MS附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)和ABA(0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L)，另附加7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖，pH 5.8。在上述添加不同激素配比的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)，每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同1.2.1。芽誘導(dǎo)10～15 d后，統(tǒng)計(jì)各處理叢生芽誘導(dǎo)及芽生長(zhǎng)情況，確定最適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 AgNO3質(zhì)量濃度對(duì)黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 為了研究AgNO3質(zhì)量濃度對(duì)黃瓜芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響，在篩選出的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別附加不同質(zhì)量濃度的AgNO3(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L)，培養(yǎng)條件同1.2.1。每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)2周后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目及生長(zhǎng)情況。

1.2.4 苗齡對(duì)黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 分別以培養(yǎng)4，5，6，7 d的14-1無(wú)菌苗為材料，切去子葉端部2/3并附帶1 mm的子葉柄，采用豎直方式插入MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.1。每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)2周后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目及生長(zhǎng)情況。

1.2.6 接種方式對(duì)黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 以5 d苗齡的14-1無(wú)菌苗為材料，切除子葉端部2/3并附帶1 mm的子葉柄，以此為外植體分別以豎直插入(b1)、葉背向下平接(b2)、葉背向下子葉柄微插入(b3)的方式，接種于MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)2周后觀察并統(tǒng)計(jì)再生芽。

1.2.7 黃瓜不定芽的伸長(zhǎng)及生根培養(yǎng) 芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)按照金寶燕等[21]的方法進(jìn)行。切取再生芽轉(zhuǎn)入含有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)，待芽伸長(zhǎng)到1.5 cm左右，從主莖基部切取伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.8 數(shù)據(jù)調(diào)查與統(tǒng)計(jì) 接種外植體后進(jìn)行出芽率及出芽系數(shù)的統(tǒng)計(jì)[8]。

再生率=出芽外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100%；

再生系數(shù)=出芽總數(shù)/接種總外植體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)黃瓜再生的影響

2.1.1 6-BA和IAA不同質(zhì)量濃度組合對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響 由表1可知，適宜的6-BA和IAA激素配比能夠誘導(dǎo)14-1和26號(hào)黃瓜種質(zhì)子葉節(jié)芽的再生，但不同的激素組合對(duì)芽的再生效率不同。隨著6-BA質(zhì)量濃度的增大，黃瓜子葉芽再生率和再生系數(shù)呈增大趨勢(shì)，但在一定質(zhì)量濃度(≥2.0 mg/L)的6-BA下，芽再生率和再生系數(shù)隨著IAA質(zhì)量濃度的增大先增加后減小。較低的6-BA質(zhì)量濃度(0.5～1.0 mg/L)及較高的IAA質(zhì)量濃度(0.3～0.5 mg/L)組合時(shí),不能有效地誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。在激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，14-1的子葉節(jié)不定芽的再生效果較好，再生率可達(dá)76.70%，再生系數(shù)可達(dá)2.08(圖1B)。 26號(hào)子葉節(jié)的再生隨激素質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)同14-1，但其在激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上再生效率較高，再生芽的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，再生率和再生系數(shù)分別可達(dá)78.67%和2.10。

表 1 6-BA和IAA不同質(zhì)量濃度組合對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

2.1.2 6-BA和ABA不同質(zhì)量濃度組合對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響 分別對(duì)14-1和26號(hào)黃瓜種質(zhì)的子葉節(jié)進(jìn)行6-BA和ABA組合的芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，10 d 后可見(jiàn)2份種質(zhì)的子葉節(jié)處都有芽點(diǎn)出現(xiàn)。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)到15 ～18 d后，子葉節(jié)部位有大量叢生芽點(diǎn)出現(xiàn)，且芽點(diǎn)略有伸長(zhǎng)。由表2可知，不同激素組合對(duì)不同基因型黃瓜芽再生率的影響不同。較低質(zhì)量濃度的6-BA (0.5～1.0 mg/L)與較高質(zhì)量濃度的ABA(2.0 mg/L)組合時(shí)，14-1種質(zhì)的子葉節(jié)不能誘導(dǎo)出不定芽；而在較低質(zhì)量濃度的6-BA(0.5～1.0 mg/L)下，26號(hào)種質(zhì)的子葉節(jié)芽再生率高于14-1。14-1種質(zhì)的子葉節(jié)在3.0 mg/L 6-BA與2.0 mg/L ABA組合時(shí)再生效果較好，再生率為78.30%，再生系數(shù)為2.14(圖1C)；而26號(hào)種質(zhì)的子葉節(jié)則在4.0 mg/L 6-BA與1.5 mg/L ABA 組合時(shí)再生效果較好，再生率可達(dá) 73.33%，再生系數(shù)可達(dá)2.08。

黨的十九大報(bào)告指出：中國(guó)特色社會(huì)主義進(jìn)入新時(shí)代，我國(guó)社會(huì)的主要矛盾已經(jīng)轉(zhuǎn)化為人民日益增長(zhǎng)的美好生活需要和不平衡不充分的發(fā)展之間的矛盾。人民需要什么，需要解決什么，這是黨面臨的主要任務(wù)，是黨的奮斗目標(biāo)，黨的十九大報(bào)告對(duì)此指明了方向。生老病死是人生常態(tài)，生而快樂(lè)、老有所養(yǎng)、病有所醫(yī)、死而安詳，無(wú)疑是人民美好生活的具體體現(xiàn)。上述兩個(gè)案例說(shuō)明，我國(guó)醫(yī)療保障還有不如意的地方，30多年醫(yī)療改革還存在不夠徹底的地方。基于此，對(duì)進(jìn)一步完善我國(guó)醫(yī)療改革提出如下建議。

表 2 6-BA和ABA不同質(zhì)量濃度組合對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

圖 1 黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)芽的再生過(guò)程

2.2 AgNO3質(zhì)量濃度對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

14-1和 26號(hào)黃瓜種質(zhì)的子葉節(jié)分別在添加 3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA、4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同AgNO3質(zhì)量濃度對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，0.5～1.5 mg/L的 AgNO3對(duì)黃瓜子葉節(jié)不定芽的生成都有促進(jìn)作用，且與不加AgNO3時(shí)相比差異顯著，其中以AgNO3為1.0 mg/L時(shí)再生效果最好，14-1和26號(hào)的再生率分別達(dá)到86.70%和85.00%，再生系數(shù)分別達(dá)到 2.77 和2.51；當(dāng)AgNO3質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L時(shí)芽的再生受到抑制，再生率和再生系數(shù)降低。

表 3 AgNO3質(zhì)量濃度對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

2.3 苗齡對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

在3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同苗齡對(duì)14-1黃瓜種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，4 d和7 d苗齡黃瓜無(wú)菌苗子葉節(jié)的再生率和再生系數(shù)都較低，4 d的無(wú)菌苗子葉呈黃綠色，極其幼嫩，子葉節(jié)不能再生；7 d的無(wú)菌苗2片子葉已完全展開(kāi)，呈深綠色且生長(zhǎng)點(diǎn)較大，但子葉節(jié)的再生率僅有51.00%；5 d苗齡的子葉節(jié)再生能力最強(qiáng)，再生率可達(dá)87.35%，再生系數(shù)可達(dá)3.38。說(shuō)明外植體的生理狀態(tài)對(duì)子葉節(jié)再生至關(guān)重要。

表 4 苗齡對(duì)黃瓜14-1種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響

2.4 子葉切割方式對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

在MS培養(yǎng)基中附加3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3，對(duì)5 d苗齡的14-1黃瓜種質(zhì)進(jìn)行子葉切割方式試驗(yàn)，結(jié)果(表5)表明，黃瓜子葉節(jié)的大小和部位對(duì)再生都有影響，以a4再生力最強(qiáng)，即切除子葉端部2/3且?guī)в? mm子葉柄時(shí)，再生率達(dá)81.53%，再生系數(shù)達(dá)2.09。

表 5 子葉切割方式對(duì)黃瓜14-1種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響

2.5 接種方式對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響

接種方式對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生也有一定的影響。接種方式對(duì)黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)再生的影響見(jiàn)表6。

表 6 接種方式對(duì)黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)再生的影響

由表6可知，接種方式對(duì)黃瓜子葉節(jié)不定芽再生的影響沒(méi)有其他因素明顯，不同接種方式下再生率均可達(dá)80%左右，再生系數(shù)可達(dá)2.00以上，但3種接種方式對(duì)子葉再生影響仍存在顯著差異，以葉背向下子葉柄微插入的接種方式(b3)較其他2種方式的再生力強(qiáng)，再生率可達(dá)86.13%，再生系數(shù)可達(dá) 2.34；豎直插入方式(b1)再生力強(qiáng)于葉背向下平接方式(b2)。

2.6 黃瓜再生芽的伸長(zhǎng)及生根

將再生的不定芽轉(zhuǎn)入加有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，10 d左右芽伸長(zhǎng)至1.5 cm(圖1D)，將其從基部切下轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中，5～7 d后有白色的根形成(圖1E)，10 d左右大量根產(chǎn)生，形成生理狀態(tài)良好的再生植株(圖1F)。

3 討 論

黃瓜再生能力弱，且不同基因型、外植體類型對(duì)其再生的影響都有很大差異[22]。何曉明等[5]、侯愛(ài)菊等[19]研究表明，黃瓜可通過(guò)直接分化再生、愈傷組織再生、胚狀體再生和原生質(zhì)體再生等途徑再生植株，而子葉一般作為黃瓜再生較理想的外植體，可直接通過(guò)器官分化途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，縮短培養(yǎng)周期。本研究以歐洲型黃瓜14-1和華北型黃瓜26號(hào)為試驗(yàn)材料，以子葉為外植體分析了多個(gè)因素對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生的影響，建立了黃瓜14-1和26號(hào)種質(zhì)材料的高頻再生體系，為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，對(duì)于歐洲水果型黃瓜材料14-1最適的激素配比是3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3，在此誘導(dǎo)條件下再生率可達(dá)86.70%，再生系數(shù)可達(dá)2.77，與其他激素組合有顯著差異。由于是通過(guò)器官直接發(fā)生途徑，因此此過(guò)程中最好不要產(chǎn)生過(guò)多的愈傷組織，而6-BA和ABA組合可抑制愈傷組織的形成，提高芽分化率。王艷蓉等[11]對(duì)S05和S06 2個(gè)黃瓜基因型的芽誘導(dǎo)試驗(yàn)也得出了相似的結(jié)論，但其試驗(yàn)中6-BA質(zhì)量濃度是3.0 mg/L，ABA的質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/L。華北型自交系黃瓜材料26號(hào)適宜的芽誘導(dǎo)激素組合是 4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+1.0 mg/L AgNO3，在此誘導(dǎo)條件下再生率可達(dá)到85.00%，再生系數(shù)可達(dá)到2.51。薛丹丹等[12]對(duì)津研4號(hào)芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，在激素組合未加AgNO3的條件下，同為華北型的津研4號(hào)出芽率和出芽系數(shù)分別為 85.00% 和2.51。此外，趙雋等[7]和趙宇瑛等[13]的研究也表明，華北型黃瓜較適宜的激素組合是6-BA和IAA。14-1和26號(hào)黃瓜材料的最適芽誘導(dǎo)激素組合不同，這主要是由于基因型不同所致。

研究表明，AgNO3可有效促進(jìn)器官發(fā)生[23]，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3，對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，未加AgNO3時(shí)，6-BA+IAA組合子葉切口處產(chǎn)生的愈傷組織較6-BA+ABA組合多，添加AgNO3后則不易產(chǎn)生愈傷組織，說(shuō)明AgNO3抑制了愈傷組織的形成。本研究中1.0 mg/L的AgNO3對(duì)芽誘導(dǎo)效果最好，這與李建欣等[24]的結(jié)果一致。還有研究表明，促進(jìn)黃瓜不定芽再生的AgNO3質(zhì)量濃度為2.0 mg/L[11-20]，這可能是由于所使用材料的基因型及其生理狀態(tài)等因素不同所致。遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究也表明，向黃瓜再生和篩選培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3能夠有效促進(jìn)抗性芽的再生，說(shuō)明AgNO3在遺傳轉(zhuǎn)化中對(duì)于抗性芽的再生具有關(guān)鍵作用[25-27]。

苗齡是影響黃瓜再生的關(guān)鍵因子之一，不同苗齡的子葉再生能力是不同的。Colijn-Hooymans等[15]報(bào)道，再生能力與無(wú)菌苗的發(fā)育階段有關(guān)，當(dāng)子葉處于垂直生長(zhǎng)階段，其再生頻率較高，而當(dāng)子葉處于水平生長(zhǎng)(2片子葉張開(kāi))階段時(shí)，其再生能力顯著降低。本研究表明，5 d苗齡的無(wú)菌苗，子葉全部轉(zhuǎn)綠，2片子葉呈豎直狀態(tài)且微分開(kāi)時(shí)芽的再生效果最好，隨著苗齡的增大，其再生率降低。這與韓欣等[16]、薛丹丹等[12]的研究結(jié)果一致；而趙雋等[7]研究認(rèn)為，10 d苗齡的黃瓜子葉再生效果較好，Colijn-Hooymans等[15]發(fā)現(xiàn)苗齡為3～5 d的子葉外植體的不定芽發(fā)生率最高，梅茜等[14]則認(rèn)為1～2 d苗齡的芽再生率較高。上述研究結(jié)果的差異，主要是由基因型、生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件等因素造成的。

黃瓜再生可通過(guò)子葉、真葉、下胚軸、胚根、胚和子葉節(jié)等外植體進(jìn)行，但較為理想的再生方式是子葉再生，其子葉的大小和部位又是影響再生的關(guān)鍵因素。趙雋等[7]研究表明，保留2片子葉，且各切除子葉的1/3時(shí)外植體出芽最好；范愛(ài)麗等[8]認(rèn)為，保留單片子葉，下胚軸縱切，去除頂芽并切除此子葉的2/3是最佳的切割方式。本研究結(jié)果表明，切除子葉端部2/3并帶有1 mm子葉柄時(shí)再生率可達(dá)81.53%，再生系數(shù)可達(dá)2.09，且以葉背向下子葉柄微插入的方式接種，其不定芽的再生最好。

黃瓜再生體系研究中關(guān)于外植體具體的接種方式目前沒(méi)有詳細(xì)的闡述，大多數(shù)研究是以平鋪方式進(jìn)行的，范愛(ài)麗等[8]認(rèn)為豎直插入為最佳的接種方式，本試驗(yàn)以葉背向下子葉柄微插入培養(yǎng)基的方式接種芽的再生最佳。外植體的接種方式對(duì)不定芽再生造成的影響可能與植物體的極性有關(guān)，具體機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Liu L Y,Duan L S,Zhang J C,et al.Cucumber (CucumissativusL.) over-expressing cold-induced transcriptome regulator ICE1 exhibits changed morphological characters and enhances chilling tolerance [J].Scientia Horticulturae,2010,124:29-33.

[2] Tabei Y,Kitade S,Nishizawa Y.Transgenic cucumber plants ha-rboring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytiscinerea) [J].Plant Cell Reports,1998,17:159-164.

[3] Kielkiewicz M,Gajc-Wolska J,Slusarz S,et al.Growth development and yield of transgenic 35S-thaumatin Ⅱ-expressing cucumber plants-open field evaluation [J].Scientia Horticulturae,2012,143:82-91.

[4] 張若緯，顧興芳,王 燁,等.基因型和6-BA對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生頻率的影響 [J].中國(guó)蔬菜,2009(22):45-48.

Zhang R W,Gu X F,Wang Y,et al.Effects of genotypes and 6-BA on regeneration frequency of cotyledonary nodes in cucumber (CucumissativusL.) [J].China Vegetables,2009(22):45-48.(in Chinese)

[5] 何曉明,林毓娥.黃瓜子葉和下胚軸的離體培養(yǎng) [J].植物生理學(xué)通訊,2001,37(5)：423-424.

He X M,Lin Y E.Invitroculture of cotyledon and hypocotyl inCucumissativus[J].Plant Physiology Communications,2001,37(5):423-424.(in Chinese)

[6] 杜勝利,魏惠軍,魏愛(ài)民,等.苗齡、基因型和外植體類型對(duì)黃瓜離體器官發(fā)生的影響 [J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,6(4):1-5.

Du S L,Wei H J,Wei A M,et al.Effects of seedling stage, genotype and explant type oninvitrosomatic organogenesis of cucumber [J].Tianjin Agricultural Science,2000,6(4):1-5.(in Chinese)

[7] 趙 雋,王 華,潘俊松,等.黃瓜子葉節(jié)離體再生體系的研究 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2004,22(1):43-53.

Zhao J,Wang H,Pan J S,et al.Invitroculture and plantlet regeneration from cotyledonary nodes of cucumber(CucumissativusL.) [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2004,22(1):43-53.(in Chinese)

[8] 范愛(ài)麗,孫艷麗,徐凌飛,等.黃瓜子葉節(jié)再生體系優(yōu)化研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,34(9):69-73.

Fan A L,Sun Y L,Xu L F,et al.Optimum study ofinvitroculture and plantlet regeneration system from cotyledonary nodes of cucumber (CucumissativusL.) [J].Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry:Natural Science Edition,2006,34(9):69-73.(in Chinese)

[9] 趙秀娟,吳定華.黃瓜的組織培養(yǎng) [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19(4):125-126.

Zhao X J,Wu D H.Tissue culture of cucumber [J].Journal of South China Agricultural University,1998,19(4):125-126.(in Chinese)

[10] 董靈迪.黃瓜組織培養(yǎng)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(1):23.

Dong L D.Studies on tissue culture cucumber [J].Journal of Southwest Agricultural University,2000,22(1):23.(in Chinese)

[11] 王艷蓉,陳麗梅,潘俊松,等.黃瓜子葉高效再生體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2006,24(2):152-156.

Wang Y R,Chen L M,Pan J S,et al.Establishment of high effective regeneration system in cucumber(CucumissativusL.) and agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2006,24(2):152-156.(in Chinese)

[12] 薛丹丹,張鳳生,王保菊,等.黃瓜再生體系的建立 [J].北方園藝，2010(7):119-121.

Xue D D,Zhang F S,Wang B J,et al.The regeneration system of cucumber [J].Northern Horticulture,2010(7):119-121.(in Chinese)

[13] 趙宇瑛,李永輝,李叢玉,等.6-BA、NAA和IAA對(duì)黃瓜子葉離體培養(yǎng)分化的影響 [J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,4(3):26-28.

Zhao Y Y,Li Y H,Li C Y,et al.Influences of 6-BA,NAA and IAA on cotyledons differentiation of cucumberinvitro[J].Journal of Yangtze University:Natural Science Edition,2007,4(3):26-28.(in Chinese)

[14] 梅 茜,張興國(guó).黃瓜組織培養(yǎng)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,24(3):266-267.

Mei Q,Zhang X G.Studies on tissue culture cucumber [J].Journal of Southwest Agricultural University,2002,24(3):266-267.(in Chinese)

[15] Colijn-Hooymans C M,Hakkert J C,Jansen J J.Competence for regeneration of cucumber cotyledons is restricted to specific developmental stages [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1994,39:211-217.

[16] 韓 欣,張衛(wèi)華,曹齊衛(wèi),等.黃瓜子葉節(jié)再生體系的建立 [J].吉林蔬菜,2009(2):86-87.

Han X,Zhang W H,Cao Q W,et al.The establishment of regeneration system from cotyledonary nodes ofCucumissativusL. [J].Jilin Vegetables,2009(2):86-87.(in Chinese)

[17] 張衛(wèi)華,朱妍妍,王志峰,等.三個(gè)不同基因型黃瓜再生體系的優(yōu)化研究 [J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(6):5-7.

Zhang W H,Zhu Y Y,Wang Z F,et al.Studies on optimizing cucumber regeneration system of three different genotypes [J].Shandong Agricultural Sciences,2007(6):5-7.(in Chinese)

[18] 余陽(yáng)俊,朱其杰.黃瓜成熟胚離體培養(yǎng)中的胚狀體誘導(dǎo)和植株再生 [J].植物生理學(xué)通訊,1992,28(1):37-39.

Yu Y J,Zhu Q J.Embryoid induction aud plantlet regeneration in mature embryos of cucumberinvitro[J].Plant Physiology Communications,1992,28(1):37-39.(in Chinese)

[19] 侯愛(ài)菊,朱延明,楊愛(ài)馥,等.誘導(dǎo)黃瓜直接器官發(fā)生主要影響因素的研究 [J].園藝學(xué)報(bào),2003,30(1)：101-103.

Hou A J,Zhu Y M,Yang A F,et al.Main factors influencing the frequency of direct organogenesis of cucumberinvitro[J].Acta Horticulturae Sinica,2003,30(1):101-103.(in Chinese)

[20] 張若緯,顧興芳,王 燁,等.不同黃瓜基因型子葉再生體系的建立 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25(增刊):50-54.

Zhang R W,Gu X F,Wang Y,et al.Regeneration system establishment from cotyledons in different cucumber (CucumissativusL.) genotypes [J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2010,25(Suppl.):50-54.(in Chinese)

[21] 金寶燕,蘇 華,任華中.影響黃瓜直接不定芽誘導(dǎo)的品種等因素研究 [J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(6):45-48.

Jin B Y,Su H,Ren H Z.Effects of cultivar etc on direct shoot induction from cotyledonary nodes of cucumber [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2006,22(6):45-48.(in Chinese)

[22] Sarmento G S,Alpert K,Tang F A.Factors influencing agro-bacterium tumefaciens-mediated transformation and expression of kanamycin resistance in Pickling cucumber [J].Plant Cell Organ Cult,1992,31:185-193.

[23] 張 鵬,凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究 [J].植物學(xué)報(bào),1995,37(11):902-908.

Zhang P,Ling D H.Enhancement of plant regeneration rate ofBrassicaparachinensisculturedinvitro[J].Acta Botanica Sinica,1995,37(11):902-908.(in Chinese)

[24] 李建欣,李建吾,葛桂民.黃瓜子葉離體再生體系研究 [J].長(zhǎng)江蔬菜,2008(1):44-46.

Li J X,Li J W,Ge G M.Invitroculture and plantlet regeneration from cotyledon ofCucumissativusL. [J].Journal of Changjiang Vegetables,2008(1):44-46.(in Chinese)

[25] 賴 來(lái),潘俊松,何歡樂(lè),等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MADS-box基因轉(zhuǎn)化黃瓜初步研究 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2007,25(4):374-382.

Lai L,Pan J S,He H L,et al.Agrobacterium-mediated genetic transformation of cucumber(CucumissativusL.) withMADS-boxlike gene [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2007,25(4):374-382.(in Chinese)

[26] Perl A,Aviv D,Galun E.Ethylene andinvitroculture of potato:Suppression of ethylene generation vastly improves protoplast yield,planting efficiency and transient expression of an alien gene [J].Plant Cell Rep,1988,7:403-406.

[27] DeBlock M,DeByouwer D,Tenning P.Transformation ofBra-ssicanapusandBrassicaderaceausingAgrobacteriumtumefaciensand the expression of thebarandneogenes in the transgenic plants [J].Plant Physiol,1989,91:694-701.