王坤，李海濤，張潤(rùn)祥，朱言柱，劉艷環(huán)，馮卓，苗利光

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112)

白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是由位于第4號(hào)染色體上的單個(gè)基因編碼的一種單鏈多肽分子，分子質(zhì)量為15 500，由133個(gè)氨基酸組成。IL-2肽鏈上第58位、第105位是半胱氨酸(Cys)殘基，經(jīng)翻譯、加工后形成二硫鍵及第3位蘇氨酸(Thr)的糖基化，其中二硫鍵對(duì)于活性的保持具有重要的作用[1]。IL-2在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要作用，是一種免疫增強(qiáng)劑，具有抗病毒、抗腫瘤及改善和提高機(jī)體免疫功能的作用。可提高人體對(duì)病毒、細(xì)菌、原蟲等感染的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等的能力[2]。在臨床上，應(yīng)用IL-2有許多副作用，常見有發(fā)燒、肌肉痛、寒戰(zhàn)、嘔吐、腹瀉等流感樣癥狀。另外，還觀察到呼吸困難、腎功能效率不足、消化道紊亂、血壓降低、冷漠、疲倦或皮損等癥狀[3]。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)人白細(xì)胞介素-2(hIL-2)副作用與分子表面結(jié)合CD25結(jié)合有關(guān)[4]的機(jī)理，在不改變hIL-2空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上優(yōu)化hIL-2的氨基酸序列，使修飾后的hIL-2(mhIL-2)蛋白失去了與CD25亞基結(jié)合的能力[5]。利用工程技術(shù)制備出mhIL-2。分別制備出不同緩沖體系及緩沖液，通過離子交換法和凝膠過濾法捕獲和純化mhIL-2，篩選出純化mhIL-2的最佳方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1試劑mhIL-2凍干粉(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究室制備)；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；十二烷基磺酸鈉(Sigma公司)；hIL-2 Elisa kit(上海卓康生物科技有限公司)；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Centifuge 5415R型低溫冷凍離心機(jī)(EPPENDORF公司)；AKTA Purifier 10蛋白純化系統(tǒng)(美國(guó)GE Healthcare公司)；ALPHA2-4LP Plus型冷凍干燥機(jī)(CHRIST公司)；SHZ-82型恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra型電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+型分子成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1離子交換法分別配制各個(gè)緩沖體系的結(jié)合液和洗脫液，即A液和B液。乙酸鈉-乙酸緩沖體系(A液0.05mol/L乙酸鈉，乙酸調(diào)至pH 4.0；B液為A液中加入1mol/L NaCl)；檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖體系(A液為0.02mol/L檸檬酸鈉，用檸檬酸調(diào)至pH 4.0；B液為A液中加入1mol/L NaCl)；甲酸鈉-甲酸緩沖體系(A液0.05mol/L甲酸鈉，用甲酸調(diào)至pH 4.0；B液為A液中加入1mol/L NaCl)。

所有緩沖液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾、脫氣后備用。分別用各緩沖體系的A液溶解凍干樣品，用A液平衡管道，弱陽離子交換柱Sepharose Fast Flow室溫放置30min后連接蛋白純化儀，柱子平衡好后紫外調(diào)零注射器加樣；用B液將穿透峰洗回基線；收集器收集洗脫峰。

1.2.2凝膠過濾法第1種緩沖液(0.02mol/L乙酸鈉、0.001mol/L MgCl2、10%甘油，用乙酸調(diào)至pH 3.7)；第2種緩沖液(0.02mol/L乙酸鈉、0.1mol/L NaCl、3%甘油，用乙酸調(diào)至pH 3.7)；第3種緩沖液(0.02mol/L乙酸鈉、0.001mol/L MgCl2，用乙酸調(diào)至pH 3.7)。

所有緩沖液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾、脫氣后備用；緩沖液平衡管道，將凝膠過濾柱G-50室溫放置30min后連接蛋白純化儀，柱子平衡好后紫外調(diào)零，注射器加樣；收集器收集蛋白峰。

1.2.3SDS-PAGE電泳樣品純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。配制15%分離膠、5%濃縮膠。電泳條件50V/膠 30min，90V/膠，恒流；染色液(0.25% G-250、45%甲醇、10%乙酸)；脫色液(45%甲醇、10%乙酸)。染色過夜后脫色至背景清楚，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行觀察分析。

1.2.4mhIL-2濃度測(cè)定采用hIL-2 Elisa kit測(cè)定mhIL-2濃度。標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為15pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1 000pg/mL。將純化的mhIL-2 10倍倍比稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行測(cè)定，450nm處讀取各樣本的OD值。具體試驗(yàn)步驟參考試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換法捕獲目的蛋白

注射器加樣1mL，B液100%洗脫2min。mhIL-2在粗品中所占百分比固定、捕獲蛋白占總蛋白比例高的方法效果最好。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸鈉-乙酸緩沖體系洗脫峰與穿透峰比值高，捕獲效果最好，見圖1～圖3。

1.穿透峰；2.洗脫峰 1.penetration peaks;2.elution peak

1.穿透峰；2.洗脫峰 1.penetration peaks;2.elution peak

1.穿透峰；2.洗脫峰 1.penetration peaks；2.elution peak

2.2 凝膠過濾法精純目的蛋白

選擇最佳緩沖體系純化的目的蛋白進(jìn)行凝膠過濾，結(jié)果表明，第1種緩沖液中鹽與蛋白質(zhì)無法分離；第2種緩沖液雖可以分離，但是分離效果較差，蛋白峰和鹽峰不能完全分開；第3種緩沖液可以完全分開，見圖4～圖6。

1.鹽峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

1.鹽峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

2.3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)mhIL-2純度

分別經(jīng)乙酸鈉-乙酸緩沖體系離子交換法和第3種緩沖液凝膠過濾脫鹽后的純品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到單一的蛋白條帶，大小為15Ku左右。與目的蛋白大小相符。見圖7。

2.4 mhIL-2濃度檢測(cè)

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、450nm下讀取的各檢測(cè)孔OD值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得出方程y=3E-0.6X2-0.005X+2.276，R2=0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和目的蛋白的OD值計(jì)算出mhIL-2的濃度為0.49mg/mL。見表1、圖8。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單、高效的離子交換法捕獲目的蛋白，由于重組IL-2 PI約為5，所以選擇弱陽離子交換柱Sepharose Fast Flow。緩沖液pH對(duì)離子交換的成功非常重要，緩沖液緩沖范圍的pH和樣品的PI值應(yīng)相差1～2純化效果最好，所以試驗(yàn)緩沖液pH值為4最佳。

1.鹽峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

M.蛋白質(zhì)預(yù)染MarKer；1.純化樣品M.Plus prestained protein ladder;1.purified sample

圖8 hIL-2 Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1Elisa法測(cè)定mhIL-2濃度

Table1ThedetectionofmhIL-2concentrationbyElisa

標(biāo)準(zhǔn)品 StandardmhIL-2濃度(pg/mL)15501002505001000XOD1.1531.0250.8420.5710.1890.1010.612

凝膠過濾法中柱子的選擇以目的蛋白分子質(zhì)量為基礎(chǔ)，pH 3.7的緩沖液相對(duì)堿性蛋白質(zhì)更容易脫鹽，精細(xì)純化目的蛋白。純化蛋白如不長(zhǎng)期保存，可在第3種脫鹽緩沖液加入減弱蛋白甘油，使之和柱床非特異性結(jié)合。本研究篩選的純化方法簡(jiǎn)單、高效，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

[1]常瑞雪,顏天華,王秋娟,等.白細(xì)胞介素-2及其相關(guān)藥物的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,2011,(1):1-7.

[2]高晉.重組人白介素-2的純化工藝研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2012:54.

[3]Whittington R.,D.Faulds.Interleukin-2.A review of its pharmacological properties and therapeutic use in patients with cancer[J].Drugs,1993,46(3):446-514.

[4]Epstein AL,Mizokami MM,Jiali Li,et al.Identification of a protein fragment of interleukin 2 responsible for vasopermeability[J].J Natl Cancer Inst,2003,95(10):741-749.

[5]王松.CD25結(jié)合位點(diǎn)修飾性hIL-2在畢赤酵母中的表達(dá)及活性鑒定[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012：60.