黃林靜，王淑君，何金波，馬迎春，應(yīng)磊，陳錫文，王萬鐵

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.赤峰上京內(nèi)分泌?？漆t(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 實驗動物中心，浙江 溫州 325035）

·論 著·

氯離子通道阻滯劑通過抑制MAPK通路減輕低氧高二氧化碳性肺血管收縮

黃林靜1，王淑君2，何金波1，馬迎春1，應(yīng)磊1，陳錫文3，王萬鐵1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.赤峰上京內(nèi)分泌?？漆t(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰 024000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 實驗動物中心，浙江 溫州 325035）

目的：探究氯離子通道阻滯劑尼氟滅酸對低氧高二氧化碳性肺血管收縮（HHPV）的影響及與MAPK信號通路的關(guān)系。方法：采用大鼠HHPV模型，將所有二級肺動脈環(huán)隨機分為：常氧組（N組）、低氧高二氧化碳組（H組）、DMSO組（HD組）、尼氟滅酸組（NFA組）、尼氟滅酸+SB203580組（NFA+SB組）、尼氟滅酸+U0126組（NFA+U組），按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性測定的方法測定各組肺動脈環(huán)的張力變化。結(jié)果：NFA+SB組、NFA+U組二級肺動脈環(huán)的收縮峰值較HD組均明顯下降（P＜0.05和P＜0.01），但I期快速收縮和I期快速舒張均無明顯差異（均P＞0.05）；NFA+SB組的收縮峰值較NFA組明顯下降（P＜0.05），但NFA+U組的收縮峰值較NFA組無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論：氯離子通道阻滯劑可通過抑制MAPK信號通路，減輕二級肺動脈環(huán)II期持續(xù)性收縮，并逆轉(zhuǎn)為舒張狀態(tài)，從而發(fā)揮拮抗HHPV的作用。[關(guān)鍵詞]MAPK通路；低氧高二氧化碳；肺血管收縮；氯離子通道；大鼠

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signalregulated kinase 1/2，ERK1/2）通路抑制劑PD98059能夠增強生理量H2O2引起的肺動脈舒張，并能逆轉(zhuǎn)高濃度H2O2引起的肺動脈收縮[1]。還有研究[2]表明，PD-98059不能抑制細胞外鈣離子濃度增加引起的肺動脈收縮。因此學(xué)者們認為ERK1/2的收縮效應(yīng)可能是非鈣離子依賴性的，即ERK1/2通路可能和電壓依賴性鉀離子通道關(guān)系不大。楊朝等[3]報道，肺動脈II期收縮可能和鈣激活性氯離子通道（calcium activated chloride channel，Clca）、容量激活性氯離子通道（volume sensitive chloride channels，C1swell）的激活有關(guān)。那么在低氧高二氧化碳性肺血管收縮（hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV）過程中起一定作用的Clca、C1swell是否和MAPK信號通路活化有關(guān)？本實驗采用氯離子通道阻滯劑尼氟滅酸（niflumic acid，NFA）和MAPK通路抑制劑U0126、SB203580，在急性低氧高二氧化碳條件下處理離體大鼠二級肺動脈環(huán)，觀察血管張力的變化，進而探討在HHPV中氯離子通道與MAPK通路的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備：離體組織灌流浴槽（西班牙Panlab公司）；張力換能器（西班牙Panlab公司）；Power lab八道生理記錄儀（澳大利亞Ad instruments公司）；血氣分析儀（日本希森美康醫(yī)用電子上海有限公司，AVL COMPACT3型）；自動電子天平（GB303 type，METTLER TOLEDO Group，Shanghai）；恒溫震蕩水浴儀（DSHZ-300，江蘇太倉實驗設(shè)備廠）。

1.1.2 藥品和試劑：SB203580（美國，Biosource公司）；U0126（美國，Biosource公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海申工生物技術(shù)有限公司）；NFA（美國，Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 制作二級肺動脈環(huán)：頸椎脫臼法處死大鼠后，開胸取出心肺，置于4 ℃ Krebs液中迅速剪開右心室，剪除左右肺葉并洗凈殘血。然后快速、輕柔分離肺右側(cè)二級肺動脈，制成3 mm長的動脈環(huán)。動脈環(huán)穿過兩個直徑0.2 mm的三角形不銹鋼小鉤后，置于盛有10 mL Krebs液的恒溫（37 ℃）離體血管灌注浴槽內(nèi)，下端固定于槽底部，上端通過張力換能器與Power lab八道生理記錄儀相連，記錄肺動脈環(huán)張力的變化[4]。

1.2.2 平衡血管并檢測內(nèi)皮細胞張力變化：調(diào)節(jié)張力微調(diào)器使二級肺動脈前負荷在60 min內(nèi)加至750 mg并維持平衡60 min，其間持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體。達到平衡后的肺動脈環(huán)用去甲腎上腺素（10-5mol/L）預(yù)收縮后觀察乙酰膽堿（10-5mol/L）的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，若出現(xiàn)85%以上的舒張反應(yīng)（舒張張力占同組去甲腎上腺素收縮張力的百分數(shù)）視為內(nèi)皮細胞完整，否則棄之不用。最后，沖洗血管環(huán)平衡30 min，記錄平衡張力值P0[4]。

1.2.3 血管環(huán)常氧反應(yīng)性測定：實驗期間持續(xù)向浴槽內(nèi)通入95% O2+5% CO2混合氣體，每隔5 min記錄平均張力值（P）1次，并計算張力變化率[P%=（PP0）/P0×100%][4]。

1.2.4 血管環(huán)低氧高二氧化碳反應(yīng)性測定：實驗前用92% N2+8% CO2的混合氣體充灌pH=7.35的灌流液（37 ℃）約40 min，將溶液瓶密閉，用血氣分析儀監(jiān)測灌流液的PO2及PCO2使其分別在30 mmHg（4.00 kPa）和60 mmHg（8.00 kPa）的范圍內(nèi)。實驗時將以上液體灌流入組織浴槽中形成急性低氧高二氧化碳模型。繼續(xù)向浴槽液體中通入上述無氧氣體并觀察60 min，注意浴槽加蓋，使浴槽中的灌流液PO2=30～35 mmHg（4.00～4.67 kPa），而PCO2則在55～60 mmHg（7.33～8.00 kPa）的范圍內(nèi)。實驗期間每隔5 min記錄平均張力值1次，并計算低氧高二氧化碳所致的張力變化率[4]。

1.2.5 肺動脈環(huán)對低氧高二氧化碳的反應(yīng)性及藥物干預(yù)：所有二級動脈環(huán)隨機分為常氧組（N組，n=8）、低氧高二氧化碳組（H組，n=8）、DMSO組（HD組，n=8）、NFA組（n=8）、NFA+SB203580組（NFA+SB組，n=8）、NFA+U0126組（NFA+U組，n=8）。急性低氧高二氧化碳條件下分別用MAPK通路抑制劑SB203580、U0126與氯離子通道阻斷NFA聯(lián)合孵育二級肺動脈環(huán)20 min，然后觀察二級肺動脈環(huán)HHPV的雙向收縮反應(yīng)變化，按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性測定的方法測定肺動脈血管環(huán)張力變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料均進行正態(tài)性檢驗，實驗數(shù)據(jù)（張力變化率）以±s表示，n為動脈環(huán)數(shù)，多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，對每個相應(yīng)的時間點上每個分組之間的作用做兩兩比較。方差齊性者采用LSD法，方差不齊者進行Dunnets T3法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧高二氧化碳對二級肺動脈環(huán)張力的直接影響N組持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體60 min，P%無明顯變化。H組持續(xù)通入92% N2+8% CO2混合氣體60 min，P%出現(xiàn)倒拋物線樣變化，即在急性低氧高二氧化碳遞質(zhì)中，二級肺動脈環(huán)呈現(xiàn)出雙向性收縮變化。其中I期快速收縮峰最大P%為（36.86 ±12.94）%，I期舒張最大P%為（-1.78±8.44）%，II期持續(xù)收縮最大P%為（47.87±4.85）%。H組與N組相比，急性低氧高二氧化碳引起的二級肺動脈環(huán)雙向收縮變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）（見圖1-2）。

圖1 低氧高二氧化碳狀態(tài)下二級肺動脈環(huán)張力變化的動態(tài)曲線

圖2 常氧與低氧高二氧化碳狀態(tài)下二級肺動脈環(huán)張力變化率的比較（n=8）

2.2 NFA單用及與SB203580、U0126聯(lián)合應(yīng)用在急性HHPV中的作用使用NFA預(yù)處理二級肺動脈環(huán)后，暴露于低氧高二氧化碳環(huán)境中20 min內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其II期收縮幅度明顯減弱，最大P%由無加阻滯劑時的（1.00±10.96）%下降至（-1.61±6.32）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；U0126與NFA聯(lián)合孵育二級肺動脈環(huán)后，II期收縮減弱幅度比單用NFA大，最大P%由單加阻滯劑時的（-1.61±6.32）%下降至（-2.71±8.51）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）；SB203580與NFA聯(lián)合孵育二級肺動脈環(huán)后，II期收縮減弱幅度比單用NFA大，最大P%由單加阻滯劑時的（-1.61±6.32）%下降至（-6.18±12.27）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。另外還發(fā)現(xiàn)：I期快速收縮和I期快速舒張均無明顯變化，與HD組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；NFA+SB組的收縮峰值較NFA組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但NFA+U組的收縮峰值與NFA組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見圖3-6）。

圖4 SB203580與NFA聯(lián)合孵育時二級肺動脈環(huán)張力變化的動態(tài)曲線

圖5 U0126與NFA聯(lián)合孵育時二級肺動脈環(huán)張力變化的動態(tài)曲線

圖6 低氧高二氧化碳狀態(tài)下四組大鼠二級肺動脈環(huán)張力變化率的比較

3 討論

氯離子是體內(nèi)最為豐富和常見的陰離子，參與細胞體積調(diào)節(jié)、pH及靜息膜電位和興奮性的調(diào)節(jié)、細胞周期的調(diào)控等各種生理過程。生物膜上存在多種類型氯離子通道，但在肺動脈平滑肌細胞上研究較多的是Clca和C1swell。細胞膜氯離子的靜息通透性相對較大，血管平滑肌細胞氯離子平衡電位（約-34 mv）比靜息膜電位（約-55 mv）高，故激活的鈣激活性氯離子通道有較強的去極化作用，在調(diào)控血管張力和收縮性方面起著重要作用[5]。楊朝等[6]發(fā)現(xiàn)，Clca在生理狀態(tài)下參與了苯福林引起的肺動脈收縮。據(jù)此有研究[7]推測：在低氧高二氧化碳狀態(tài)下，肺動脈平滑肌細胞膜的通透性會增加，因此位于細胞外的鈣離子內(nèi)流增大；與此同時細胞內(nèi)產(chǎn)生的各種體液因子也會促進平滑肌細胞內(nèi)鈣離子持續(xù)升高，最后導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，鈣激活性氯離子通道被激活，為了維持細胞膜的去極化狀態(tài)，細胞內(nèi)的氯離子大量外流，以減少細胞膜內(nèi)側(cè)的負電荷，鈣離子進一步內(nèi)流，到達一定濃度后活化Ca2+-CaM系統(tǒng)，激活平滑肌細胞的收縮蛋白，最終引發(fā)HHPV。本實驗結(jié)果顯示：在急性低氧高二氧化碳遞質(zhì)中，二級肺動脈環(huán)呈現(xiàn)出雙向性收縮變化，可能與以上機制有關(guān)。

以往研究[8]證實，氯離子通道阻滯劑可以抑制肺血管收縮，其可能是通過抑制肺血管平滑肌細胞上的Clca和C1swell的活性有關(guān)，與本實驗研究結(jié)果一致，即在急性低氧高二氧化碳狀態(tài)下，氯離子通道阻滯劑增強NFA降低二級肺動脈II期持續(xù)性收縮的峰值，甚至逆轉(zhuǎn)II期的持續(xù)收縮，發(fā)揮較明顯的血管舒張作用。另外，本實驗中使用的NFA是氯離子通道阻斷劑，可顯著抑制Clca，還可完全阻斷C1swell[9]。本研究也證實了NFA對大鼠低氧高二氧化碳性肺動脈高壓具有一定的緩解作用。

本教研室先前研究[10]顯示，ERK1/2通路抑制劑U0126以及p38MAPK抑制劑SB203580均明顯緩解HHPV中的II期持續(xù)性收縮，但對I期快速收縮（有賴于Kv和細胞外鈣離子存在）無明顯影響。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：NFA組、NFA+SB組、NFA+U組的收縮峰值較HD組均明顯下降，II期持續(xù)性收縮逆轉(zhuǎn)為舒張狀態(tài)，尤以NFA+SB組為著。這表明在急性低氧高二氧化碳狀態(tài)下，U0126及SB203580均能增強NFA降低二級肺動脈II期持續(xù)性收縮的峰值，甚至逆轉(zhuǎn)II期的持續(xù)收縮，發(fā)揮較明顯的血管舒張作用，尤以SB203580作用為明顯。

綜上所述，氯離子通道阻滯劑可通過抑制MAPK信號通路（ERK1/2和p38MAPK），減輕大鼠二級肺動脈環(huán)II期的持續(xù)性收縮，并逆轉(zhuǎn)為舒張狀態(tài)，從而發(fā)揮拮抗HHPV的作用。

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（本文編輯：吳健敏）

The blocker of chloride channels attenuated hypoxic hypercapnia pulmonary vasoconstriction through inhibiting MAPK signal pathway in rats

HUANG Linjing1, WANG Shujun2, HE Jinbo1, MA Yingchun1, YING Lei1, CHEN Xiwen3, WANG Wantie1.
1.Department of Pathophysiology, Wenzhou Medical University, Wenzhou,325035; 2.Chifeng Shangjing Incretion Specialist Hospital, Chifeng, 024000; 3.The Animal Center of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the effect of chloride channels and MAPK signal pathway in the pathological process of hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction in rats.Methods:The model of hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction rats was used, and the second branch pulmonary artery rings were randomly divided into: control group (N group), hypoxia hypercapnia group (H group), DMSO incubation group (HD group), niflumic acid incubation group (NFA group), niflumic acid+SB203580 incubation group(NFA+SB group), niflumic acid+U0126 incubation group (NFA+U group), the values of rings’ tension change were recorded via the method of hypoxia hypercapnia conditions reactivity.Results:The second pulmonary artery rings incubated by NFA+SB and NFA+U group who’s phase II persistent vasoconstrictive peak were significantly attenuated and then turn to vasodilatation compared with the HD group (P<0.05 and P<0.01) but the Phase I acute vasoconstriction and the Phase I vasodilation had no changes compared with HD (P>0.05); The second pulmonary artery rings incubated by NFA+SB group who’s vasoconstrictive peak was significantly attenuated compared with the NFA group (P<0.05), but the NFA+U group didn’t change (P>0.05).Conclusion:Chloride channel blocker can inhibit MAPK signaling pathway, reduces the second branch pulmonary artery rings’ phase II sustained contraction, and reversed diastolic state, so as to play the role of HHPV antagonists.

MAPK signal pathway; hypoxia hypercapnia; pulmonary vasoconstriction; chloride channel; rats

R363

A

1000-2138（2014）01-0015-05

2013-05-13

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y2080760）；浙江省中醫(yī)藥重點學(xué)科建設(shè)計劃項目（2012-XK-A28）。

黃林靜（1988-），女，河北邢臺人，碩士生。

王萬鐵，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wwt@wzmc.edu.cn。