陸地，毛晨熙，金培峰，王玨，孫成超

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

大鼠心肌組織提取物抑制缺氧和無(wú)血清誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡

陸地，毛晨熙，金培峰，王玨，孫成超

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015）

目的：觀察大鼠心肌組織提取物抑制以缺氧和無(wú)血清方法誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡現(xiàn)象并初步探討其機(jī)制。方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建立缺氧和無(wú)血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，超速離心法提取大鼠心肌組織提取物，以CCK8法檢測(cè)缺氧和無(wú)血清條件下不同濃度心肌組織提取物作用后的細(xì)胞數(shù)量，篩選適宜提取物作用濃度；相差顯微鏡下觀察正常對(duì)照組、凋亡模型組和心肌組織提取物組細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步以Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)變化，計(jì)數(shù)染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例，Western blot法檢測(cè)各組caspase-3蛋白表達(dá)量。結(jié)果：隨著心肌組織提取物濃度的升高，缺氧和無(wú)血清條件下細(xì)胞存活的數(shù)量也隨之增加，心肌組織提取物的最佳作用濃度為100μg/mL。心肌組織提取物組、正常對(duì)照組與凋亡模型組比較，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，caspase-3蛋白裂解活化程度顯著降低。結(jié)論：大鼠心肌組織提取物能夠抑制缺氧和無(wú)血清誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，其濃度超過(guò)100μg/mL時(shí)抑制細(xì)胞凋亡作用明顯，caspase-3參與了該現(xiàn)象的調(diào)控。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；組織提取物；細(xì)胞凋亡；caspase-3；大鼠

心肌梗死一直是全球范圍內(nèi)致死致殘的主要疾病之一[1]，現(xiàn)行心梗主要治療方式如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）及藥物治療等難以恢復(fù)心梗時(shí)損失的心肌細(xì)胞，無(wú)法改善梗死區(qū)瘢痕形成，影響了患者遠(yuǎn)期預(yù)后[2]。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心梗被發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，它能夠促進(jìn)梗死部位細(xì)胞血管新生，改善瘢痕形成，促進(jìn)心功能恢復(fù)，改善遠(yuǎn)期預(yù)后[3-6]。但是，心梗區(qū)缺血、缺氧等因素導(dǎo)致干細(xì)胞移植后凋亡現(xiàn)象發(fā)生顯著，降低了細(xì)胞移植的療效[7]。大鼠心肌組織提取物是超速離心法得到的多細(xì)胞因子混合物，Liu等[8]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在含心肌組織提取物的無(wú)血清DMEM中存活一段時(shí)間，提示心肌組織提取物有一定促生長(zhǎng)、抗凋亡的作用。本研究以缺氧和無(wú)血清模擬心梗區(qū)缺氧缺血微環(huán)境，觀測(cè)大鼠心肌組織提取物抑制缺氧和無(wú)血清引起的細(xì)胞凋亡，并探討其抗凋亡機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠（Sprague-Dawley rats，二級(jí)動(dòng)物），80～100 g，雄性，1～2只，250～280 g，雄性1～2只，購(gòu)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有研究都經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑胎牛血清、0.25%胰酶、低糖DMEM等購(gòu)自Gibico公司，Hoechst凋亡試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，CCK8試劑盒購(gòu)自同仁研究所，抗鼠caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)cell signaling公司，抗鼠β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，羊抗兔二抗購(gòu)自earth公司，細(xì)胞缺氧培養(yǎng)盒、厭氧產(chǎn)氣袋、氧氣指示劑均購(gòu)自日本三菱公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)：80～100 g SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡3～5 min，剪下腿部，超凈臺(tái)內(nèi)分離腿部肌肉，取股骨、脛骨，PBS洗去殘留血液，置于PBS液中備用。剪去股骨、脛骨兩端骨骺，完全DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔中細(xì)胞，吹打后接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。原代培養(yǎng)48 h換液一次，細(xì)胞達(dá)80%～90%時(shí)1:2或1:3傳代，48 h換液一次。取3～4代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 心肌組織提取物提?。喝?50～280 g SD大鼠，10%水合氯醛腹腔深度麻醉，打開(kāi)胸腔，剪取心臟?？焖僮屑?xì)剪下左心室肌肉，稱(chēng)重、剪碎，放置于冰面?zhèn)溆谩⒓羲樾募〗M織移至15 mL離心管，以0.5 g:2 mL比例加入預(yù)冷PBS，組織勻漿機(jī)勻漿4～5次，每次20～30 s，細(xì)胞超聲裂解器裂解3～4次，每次5～10 s。隨后將收集的組織懸液超高速離心機(jī)離心（50000 g） 30 min，收集上清液[7]。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量提取物蛋白濃度，最后超凈臺(tái)內(nèi)4μm過(guò)濾器濾過(guò)得到無(wú)菌心肌組織提取物。1.3.3無(wú)氧模型的建立：細(xì)胞缺氧培養(yǎng)盒內(nèi)置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶、厭氧產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑，加入一定量的水。厭氧產(chǎn)氣袋接觸空氣后即刻吸收O2，產(chǎn)生CO2，當(dāng)產(chǎn)生無(wú)氧狀態(tài)時(shí)（O2＜0.1%），指示劑將由淺紫色變?yōu)榉奂t色。

1.3.4 CCK8測(cè)量缺氧和無(wú)血清條件下不同濃度心肌組織提取物作用后的細(xì)胞數(shù)量：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以1×105接種于96孔板，根據(jù)加入組織提取物濃度不同分為10μg/mL、100μg/mL、500μg/mL 3組，加上正常對(duì)照組和凋亡模型組一共5組，每組6個(gè)復(fù)孔。待12 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每孔棄去原培養(yǎng)液，分別加入不同濃度提取物和DMEM的混合培養(yǎng)液，置于無(wú)氧培養(yǎng)盒內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，每孔棄去原混合培養(yǎng)液，加入100μL DMEM和10μL CCK8，孵育4～6 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，篩選最佳濃度。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞正常有氧條件下于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 h；凋亡模型組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)氧條件下于不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；心肌組織提取物組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)氧條件下于含100μg/mL心肌組織提取物（根據(jù)CCK8結(jié)果篩選的適宜濃度）的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 h。

1.3.6 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞變化：各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理之后，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，記錄各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.7 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞核變化：細(xì)胞按4× 105～5×105接種于覆蓋無(wú)菌蓋玻片6孔板，細(xì)胞達(dá)85%～90%時(shí)，按上述進(jìn)行各組處理，處理結(jié)束，細(xì)胞用PBS洗2～3次，細(xì)胞固定液固定10 min，PBS洗2～3次，每孔加Hoechst-33258試劑1～1.5 mL，室溫避光染色10 min，PBS洗3次，封片，紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡觀察拍片。

1.3.8 計(jì)數(shù)染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例：Hoechst染色后，每組高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，熒光顯微鏡觀察拍片，Image-Pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)分析各組圖片染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例。

1.3.9 Western blot法檢測(cè)pro-caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入含1% PMSF、20%磷酸酶抑制劑的預(yù)冷裂解液中，超聲裂解6～7次，每次10 s，靜置15 min后12000 r/min離心5 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度，按20μg/每孔上樣，SDS-PAGE電泳，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加一抗4 ℃過(guò)夜，次日洗膜，加二抗孵育1.5 h，再次洗膜，ECL發(fā)光，膠片顯影、定影。每個(gè)樣本重復(fù)3～5次。Quantity one分析條帶灰度值，以目的蛋白pro-caspase-3和cleaved-caspase-3的灰度值和內(nèi)參β-actin的灰度值的比值代表其相對(duì)含量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用one-way ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組相比，凋亡模型組OD值顯著下降（P＜0.05），和凋亡模型組相比10μg/mL組OD值沒(méi)有明顯改變，當(dāng)組織提取物濃度≥100μg/mL時(shí)，和凋亡模型組相比OD值有明顯的提高（P＜0.05），說(shuō)明當(dāng)組織提取物濃度達(dá)100μg/mL時(shí)能較好協(xié)助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗凋亡作用（見(jiàn)圖1）。結(jié)果提示濃度≥500μg/mL時(shí)可能有更好抗凋亡作用，但是在該濃度下培養(yǎng)基易產(chǎn)生蛋白沉淀，反而不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，所以以下實(shí)驗(yàn)中組織提取物濃度均采用100μg/mL。

圖1 各組CCK8檢測(cè)結(jié)果比較

圖2 細(xì)胞處理后相差顯微鏡下形態(tài)變化（×200）

圖3 Hoechst染色檢測(cè)各組細(xì)胞核變化（×400）

2.2 倒置顯微鏡下各組細(xì)胞變化、Hoechst染色各組細(xì)胞核形態(tài)變化以及染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例和正常對(duì)照組相比，凋亡模型組細(xì)胞皺縮變小，部分凋亡細(xì)胞成懸浮狀態(tài)。和凋亡模型組相比，心肌組織提取物組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細(xì)胞皺縮變小現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡后懸浮現(xiàn)象也較少（見(jiàn)圖2）。凋亡模型組細(xì)胞核呈現(xiàn)出不均勻的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核邊界形態(tài)也較多樣，部分細(xì)胞核染色凝聚，部分細(xì)胞核裂解產(chǎn)生凋亡小體，提示發(fā)生了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。而心肌組織提取物組和正常對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)較為均勻的藍(lán)色熒光，沒(méi)有明顯染色質(zhì)凝聚和凋亡小體現(xiàn)象，提示細(xì)胞凋亡不明顯（見(jiàn)圖3）。早期凋亡的細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，Hoechst染色呈現(xiàn)濃聚的藍(lán)色熒光，凋亡模型組每高倍鏡下染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例高于正常對(duì)照組以及心肌組織提取物組（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 高倍鏡（×400）下各組染色質(zhì)濃縮細(xì)胞所占比例

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)與正常對(duì)照組以及心肌組織提取物組相比，凋亡模型組cleavedcaspase-3表達(dá)增加明顯（P＜0.05），對(duì)照組以及心肌組織提取物組cleaved-caspase-3表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖5 不同組別cleaved-caspase-3表達(dá)情況

3 討論

在體外實(shí)驗(yàn)中，Lovastatin[9]、EGb761[10]、Lysophosphatidic acid[11]等都被發(fā)現(xiàn)能夠抑制缺氧和無(wú)血清誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，但是這些藥物對(duì)細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生一定程度的不良反應(yīng)，有的甚至在一定濃度時(shí)促進(jìn)了干細(xì)胞凋亡[10]。因此，如何安全有效地提高移植后干細(xì)胞存活率仍是目前研究的一大熱點(diǎn)、難點(diǎn)[7]。本研究中使用的心肌組織提取物是一類(lèi)多細(xì)胞因子混合物[12]，與之前的抗凋亡藥物相比，心肌組織提取物不良反應(yīng)小，具有相對(duì)穩(wěn)定的組織相容性，且來(lái)源較為穩(wěn)定。Liu等[8]和Chang等[13]發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清狀態(tài)下一定濃度心肌組織提取物能夠協(xié)助骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生存2～3 d，提示其可能有抑制缺血清引起的凋亡作用，本研究通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100μg/mL為心肌組織提取物理想的作用濃度。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主的有序的死亡，其發(fā)展過(guò)程中最明顯的證據(jù)是細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，比如細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞核中染色質(zhì)聚集濃縮，凋亡小體形成等[14]。本研究對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行相差顯微鏡觀測(cè)、Hoechst熒光核染色檢測(cè)，并對(duì)染色質(zhì)濃縮的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)心肌組織提取物組細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯凋亡形態(tài)學(xué)變化，從而證明一定濃度心肌組織提取物抑制了缺氧和無(wú)血清所誘導(dǎo)的凋亡。細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，其中線粒體扮演了凋亡調(diào)控中心的角色，細(xì)胞色素C的釋放和caspase通路的激活是其關(guān)鍵步驟，caspase-3在細(xì)胞凋亡執(zhí)行過(guò)程中發(fā)揮了最主要的作用。凋亡過(guò)程中沒(méi)有活性的pro-caspase-3激活裂解成為有活性的cleaved-caspase-3，然后參與剪切細(xì)胞凋亡過(guò)程中的許多關(guān)鍵蛋白。所以caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡模型組cleaved-caspase-3高表達(dá)，而對(duì)照組和心肌組織提取物組幾乎很少表達(dá)，說(shuō)明心肌組織提取物是通過(guò)抑制caspase-3活化，阻斷其下游蛋白的激活而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。

本研究還存在著一些不足，比如尚未進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們將通過(guò)用心肌組織提取液預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植回心梗模型體內(nèi)，以進(jìn)一步驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，體外環(huán)境下缺氧和無(wú)血清能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而一定濃度的大鼠心肌組織提取物能夠通過(guò)抑制caspase-3蛋白肌組織提取物的這一功能，為移植后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易凋亡的難題提供了一種新的解決方向。

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（本文編輯：吳健敏）

Tissue extracts from myocardium of rats protects bone marrow stromal cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis

LU Di, MAO Chenxi, JIN Peifeng, WANG Jue, SUN Chengchao.
Depart-ment of Thoracic and Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore tissue extracts from myocardium of rats protects bone marrow stromal cells (BMSC) against hypoxia/serum deprivation (SD)-induced apoptosis, and investigate its potential mechanism.Methods:The BMSC were isolated from female SD rat and cultured in vitro. The ischemic microenvironment was simulated by hypoxia/SD and tissue extracts from myocardium of rats were extracted by ultracentrifugation. Cell counting kit was used after 24 h hypoxia/SD treatment to observe the cell number of BMSC and to select the proper concentration. The inverted phase contrast microscope observation and heochst 33258 nucleus staining were used to detect the morphological changes of the cells. Western blot was used to detect the expression of caspase-3.Results:The result of cell counting kit showed that with the extracts concentration increasing, the cell number increased. The proper concentration of myocardium tissue extracts was 100μg/mL. Compared with the apoptotic model (AM) group, there were less apoptotic cells in myocardium tissue extracts group and control group. The expression level of cleaved caspase-3 detected was higher in AM group than that in the NMTE and control group.Conclusion:Tissue extracts from myocardium of rats protect BMSC against hypoxia/SD-induced apoptosis. The protective effect is significant when the extracts concentration reached 100μg/mL. The protective effect is related to caspase-3 signal pathway.

bone marrow stromal cells; tissue extract; cell apoptosis; caspase-3; rats

R654.2

A

1000-2138（2014）01-0007-05

2013-08-26

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110641）；溫州市科技局對(duì)外合作項(xiàng)目（H20090019）。

陸地（1987-），男，浙江溫州人，碩士生。

孫成超，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：suncc6@163.com。