尚發(fā)軍 艾文兵 熊志云 馮定坤 彭 智

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，湖北宜昌 443000

整合素αvβ3拮抗劑SB-273005對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

尚發(fā)軍 艾文兵 熊志云 馮定坤 彭 智

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，湖北宜昌 443000

目的檢測整合素αvβ3拮抗劑SB-273005對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)量及其磷酸化的影響。方法將C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，分對照組（0 mg/L）、SB-273005低濃度組（25 mg/L）和SB-273005高濃度組（50 mg/L）3組，采用western法檢測不同濃度的SB-273005對C6細(xì)胞踝蛋白（talin）、生存素蛋白（survivin）表達(dá)量以及其磷酸化的變化，并檢測各組蛋白條帶光密度變化。 結(jié)果 不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞talin、survivin蛋白的表達(dá)，對二者的磷酸化有明顯的抑制作用。測得對照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組蛋白條帶光密度，得出talin/β-actin比值分別為0.76、0.43、0.26（*P＜0.05）；磷酸化的talin/β-actin比值分別為0.82、0.33、0.15（*P＜0.05)。survivin/β-actin比值分別為0.84、0.21、0.09.（*P＜0.05），磷酸化的survivin/β-actin比值分別為0.19、0.04、0.01（*P＜0.05)。3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 SB-273005對大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)量及其磷酸化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；踝蛋白；生存素；SB-273005

目前研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，talin、survivin所能發(fā)揮的生物學(xué)作用與整合素αvβ3的活性狀態(tài)密切相關(guān)[1]。talin與survivin蛋白的磷酸化水平與膠質(zhì)瘤惡性程度存在關(guān)聯(lián)性，膠質(zhì)瘤的惡性程度越高，二者的磷酸化水平隨之增高[2]。因此，該實(shí)驗(yàn)2013年 12月—2014年 6月間通過采用整合素 αvβ3拮抗劑SB-273005，抑制整合素活性，觀察整合素αvβ3的活性改變后與talin、survivin的表達(dá)量及其磷酸化是否存在相關(guān)性，并探討其作用機(jī)制，以期為腦膠質(zhì)瘤的治療尋求更有效的方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)自2013年12月開始，2014年6月結(jié)束。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室提供；整合素αvβ3拮抗劑SB-273005為Dupont公司產(chǎn)品；抗talin抗體、survivin抗體、survivin磷酸化單克隆抗體購于武漢博士德生物公司；DMEM培養(yǎng)基、FBS、RIPA緩沖液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等試劑由廣州賽哲生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞樣品制備 大鼠C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待其進(jìn)入對數(shù)生長期后，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)濃度為1×104～1×105/mL，并分為對照組（0 mg/L）、nm23-H2低濃度組 （25 mg/L）和nm23-H2高濃度組（50mg/L）3組，20 h后收集細(xì)胞樣品，加入RIPA裂解緩沖液收集裂解物，取上清備用。

1.2.2 Western Blotting 樣品行 SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，牛奶封閉液封閉2～4 h，依次加入一抗（抗talin、survivin及對應(yīng)磷酸化抗體1∶1 000稀釋，室溫2 h后，加羊抗兔二抗（1∶400 0），2 h后顯影。Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細(xì)胞talin表達(dá)量及磷酸化

加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制talin表達(dá)量及磷酸化，且隨著SB-273005濃度升高，其對talin表達(dá)及磷酸化的抑制呈增高趨勢，見圖1，2，3。

圖1 talin蛋白條帶

圖2 磷酸化的talin蛋白條帶

圖4 survivin蛋白條帶

圖5 磷酸化的survivin蛋白條帶

圖3 β-actin蛋白條帶

圖6 β-actin蛋白條帶

注：圖1～6分別為各組talin、survivin、磷酸化的talin及survivin、β-actin蛋白條帶，β-actin為內(nèi)參。1為對照組,2為nm23-H2低濃度組，3為nm23-H2高濃度組。

2.2 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細(xì)胞survivin表達(dá)量及磷酸化

加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制survivin表達(dá)量及磷酸化，并且隨著SB-273005濃度升高，其對survivin表達(dá)及磷酸化的抑制呈增高趨勢。見圖4，5，6。

2.3 Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、βactin平均光密度比值均數(shù)

Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、βactin平均光密度比值均數(shù)，以數(shù)據(jù)表顯示。隨SB-273005處理濃度的增加，talin、survivin蛋白的表達(dá)量及磷酸化水平明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）；與SB-273005低濃度組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（△P＜0.05），見表1。

表1 各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)

3 討論

目前研究證實(shí)，整合素αvβ3參與多條信號通路的調(diào)控，通過與ECM配體結(jié)合，促成黏著斑復(fù)合物的形成[3]。同時，該復(fù)合物所包含的配體以及其他信號分子暴露其活化位點(diǎn)，通過與下游的染色質(zhì)片段或蛋白相互作用[4]，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

該研究結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組通過加入不同濃度的αvβ3拮抗劑SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞talin蛋白的表達(dá)，對其磷酸化有明顯的抑制作用。測得對照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分別為0.82、0.33、0.15（*P＜0.05)。3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。國內(nèi)外學(xué)者同樣證實(shí)，talin蛋白的磷酸化主要通過C-端區(qū)上的序列發(fā)揮作用，且多在細(xì)胞粘附之前，就已完成多個酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化。其中，最重要的自主磷酸化部位Tyr397在這一過程中起至關(guān)重要的作用[5]。這與實(shí)驗(yàn)中，磷酸化的talin的檢測結(jié)果相符。并提示talin有可能是整合素黏著斑形成初期所依賴的基礎(chǔ)分子，多個磷酸化位點(diǎn)為后期整合素相關(guān)信號通路激活發(fā)揮重要作用[6]。

目前認(rèn)為，整合素激活talin的可能模式是：整合素αvβ3受到信號刺激后，整合素-talin相互作用，使多個talin分子相互磷酸化而被激活。并通過對下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活，對多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路予以調(diào)控，從而發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。

與talin蛋白不同，Survivin蛋白在多個腫瘤細(xì)胞中，與P53、bcl 2蛋白存在相關(guān)性。該研究結(jié)果顯示：加入各實(shí)驗(yàn)組不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)，對二者的磷酸化有明顯的抑制作用。3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。國內(nèi)已經(jīng)有研究證實(shí)，Survivin蛋白可以通過結(jié)合caspase家族蛋白形成的DISC和細(xì)胞色素C分別激活內(nèi)源性與外源性兩條通路調(diào)控細(xì)胞的凋亡[7]。Survivin可以通過調(diào)控caspase-3的活性導(dǎo)致核糖體的磷酸化，而后者可以使細(xì)胞進(jìn)入周期，減少凋亡[8]。雖然三者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性生長等惡性生物學(xué)方面均起重要調(diào)節(jié)作用。但其具體的作用機(jī)制并不清楚。在腫瘤微環(huán)境的條件下，哪一種機(jī)制是起主導(dǎo)作用的，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，該研究表明整合素αvβ3拮抗劑SB-273005能有效地抑制talin、survivin表達(dá)量及其磷酸化程度，且均呈劑量依賴性抑制作用，為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)研究提供依據(jù)，為后期中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供新的方法。

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R3

A

1674-0742（2014）12（a）－0044-02

2014-08-27）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010CDZ068）。

尚發(fā)軍（1971-），男，湖北宜昌人，碩士研究生在讀，副主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

艾文兵（1969-），男，湖北浠水人，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：神經(jīng)膠質(zhì)瘤。郵箱：1043642574@qq.com。