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(青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021 1 生物化學與分子生物學教研室； 2 微生物學教研室； 3 附屬醫(yī)院乳腺外科； 4 2010級七年制臨床醫(yī)學專業(yè))

乳癌是全球性的女性常見惡性腫瘤之一,嚴重威脅著婦女的健康，在中國許多大中城市，乳癌已躍居女性惡性腫瘤的第一位[1]。該腫瘤隱匿期長，早期發(fā)現(xiàn)及早治療非常重要。近年來在乳癌的發(fā)病機制研究方面取得了一定進展，但對其早期診斷和臨床治療并沒有實質性突破。Toll 樣受體(TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLRs可以營造炎癥微環(huán)境導致腫瘤形成，并在腫瘤形成基礎上促進腫瘤進展。研究結果顯示，TLRs不僅在免疫系統(tǒng)細胞表達，也廣泛表達于腫瘤細胞[2-3]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中 TLRs 信號有重要作用。TLR2 和TLR4 在乳癌組織表達及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明了，本研究通過檢測乳癌組織中TLR2 和TLR4 的表達，探討其與乳癌發(fā)生發(fā)展的關系，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機收集青島市中心醫(yī)院和青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院2010年7月—2012年3月收治，經病理組織學確診的乳癌病人的新鮮癌組織及相應癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)213例。所有病人均為女性，年齡32～80歲，中位年齡54.3歲。病理類型：浸潤性非特殊型癌209例(其中浸潤性導管癌198例，浸潤性小葉癌4例，髓樣癌5例，基底細胞樣癌2例)，浸潤性特殊型癌4例(均為乳頭狀癌)。應用國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期法分期：T1期98例，T2期115例；N0期122例，N1期45例，N2期33例，N3期13例；M0期213例。所有病人術前均未接受過新輔助化療、內分泌治療及放射治療，并除外雙側原發(fā)乳癌和合并其他惡性腫瘤病人。

1.2 主要試劑

HotstarTaq DNA聚合酶由大連TaKaRa公司提

供；逆轉錄(RT)試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司擴增；引物由南京金思瑞生物工程技術服務有限公司合成；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司。

1.3 RNA提取與純化

采用TRIzol一步法提取組織總RNA，具體步驟按照說明書進行操作。滅活所提取的RNA樣品中混雜的DNA并純化RNA樣品。

1.4 TLR2和TLR4 mRNA檢測

1.4.1RT-PCR ①引物設計：TLR2和TLR4及內參照基因GAPDH引物序列見表1。②cDNA的合成：采用RT試劑盒進行cDNA合成，具體操作步驟按說明書進行。RT完成后，cDNA樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴增：用上述合成的cDNA作模板進行TLR2和TLR4擴增，內參照GAPDH擴增的上下游引物各0.4 μmol/L(1.0 μL)，其他反應體系與條件同前。并用ddH2O作為空白對照。

1.4.2PCR擴增產物檢測 將PCR擴增產物于含有0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析電泳結果。

表1 TLRs和GAPDH RT-PCR引物

1.4.3Real-time PCR檢測 以上述合成的cDNA為模板，按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說明進行Real-time PCR反應，從上述213例乳癌組織及其癌旁組織中隨機抽取30例對TLR2和TLR4基因的mRNA表達量進行定量分析比較。以GAPDH基因作為內參照，每份RNA樣品均進行3次重復檢測，取其平均Ct值用于分析。擴增引物由南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司設計合成，引物序列及產物大小同1.4.1。根據(jù)所得Ct值，應用2-△△Ct法計算乳癌組織及其相應癌旁組織中TLR2和TLR4相對表達量，每次實驗均重復3次。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 TLR2與TLR4 mRNA的表達

2.1.1TLR2 mRNA的陽性表達 部分乳癌及其相應癌旁組織TLR2 mRNA RT-PCR檢測的電泳結果見圖1，TLR2基因擴增條帶長度為264 bp，內參照基因GAPDH擴增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應癌旁組織TLR2的陽性表達率分別為92.49%(197/213)和71.3%(152/213)，乳癌組織TLR2陽性表達率明顯高于其相應癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=32.10，P<0.01)。

2.1.2TLR4 mRNA的陽性表達 部分乳癌及其相應癌旁組織TLR4 mRNA RT-PCR檢測的電泳結果見圖2，TLR4基因擴增條帶長度為510 bp，內參照基因GAPDH擴增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應癌旁組織TLR4的陽性表達率分別為95.78%(204/213)和41.78%(89/213)，乳癌組織TLR4陽性表達率明顯高于其相應癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=144.57，P<0.01)。

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖1RT-PCR檢測部分標本TLR2mRNA表達

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖2RT-PCR檢測部分標本TLR4mRNA表達

2.2 乳癌組織TLRs表達與臨床病理因素關系

乳癌組織中TLR2和TLR4 mRNA表達與腫瘤的組織學分級以及雌激素受體(ER)陽性表達、孕激素受體(PR)陽性表達均有關(χ2=4.06～30.86，P<0.05)，而TLR2 mRNA表達與抑癌基因p53的表達也有關(χ2=5.71，P<0.05)。見表2。

表2 乳癌組織TLRs表達與臨床病理因素關系(例(χ/%))

2.3 Real-time PCR檢測TLRs mRNA表達水平

乳癌組織和癌旁組織中TLR2 mRNA相對表達量分別為0.79±0.10、0.65±0.15，TLR4 mRNA相對表達量分別為0.81±0.12、0.67±0.16。乳癌組織TLR2和TLR4 mRNA表達量顯著高于其相應癌旁組織(t=4.26、3.89，P<0.05)。

3 討 論

TLRs廣泛分布于免疫細胞尤其非特異免疫細胞或細胞器膜的表面，是進化過程中比較保守的一個受體家族，是感受病原體入侵的主要受體之一[4]。很多研究顯示，腫瘤發(fā)展與慢性炎癥密切相關，多種腫瘤的生物學行為與介導炎癥的TLRs密切相關。TLRs在不同的腫瘤細胞表達有差異，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs家族至少包括12個成員，不同的TLRs其配體也有所不同。

TLR2識別譜較廣，可識別大部分已發(fā)現(xiàn)的病原體相關分子模式(PAMP)結構，其不僅是機體介導天然免疫反應的重要分子，而且在組織修復的過程中也發(fā)揮著重要作用。研究認為，在腫瘤發(fā)生前，TLR2信號途徑的持續(xù)激活是慢性炎癥持續(xù)存在進而發(fā)展為惡性腫瘤的重要原因[5]。近年來研究顯示，TLR2在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調，尤其是上皮來源的腫瘤。但乳癌組織中TLR2的表達情況尚不清楚。本研究結果顯示，乳癌組織TLR2的表達明顯上調，其在N3期(淋巴結轉移)的表達比N0期有較明顯的增高趨勢，說明TLR2在一定程度上促進了癌細胞的增殖，參與乳癌的轉移，提示TLR2可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的惡性進程，進而影響病人預后；而腫瘤的組織學分級越高，TLR2的表達率越高，提示TLR2有可能成為腫瘤分化不良的重要標志。YANG等[6]對黑色素瘤研究顯示，腫瘤細胞釋放的HSP60持續(xù)激活TLR2通路，進而激活信號轉導和轉錄激活因子，導致免疫抑制細胞因子和趨化因子釋放，促進黑色素瘤細胞的增殖和浸潤，而針對TLR2的治療能顯著降低肺部的轉移，增加荷瘤鼠的存活。我們推測，乳癌與其他腫瘤一樣，在腫瘤微環(huán)境內可能也存在著TLR2內源性配體，激活乳癌細胞TLR2信號通路，從而引起局部炎癥樣反應，并通過上述類似的機制促進癌細胞的增殖、凋亡抵抗等。因此，TLR2有望成為乳癌預后判斷指標和新的治療靶點。

TLR4普遍表達于多種腫瘤細胞，腫瘤的發(fā)展與TLR4參與激活的信號通路有密切關系。近年研究顯示，TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調。它表達于多種腫瘤細胞中，如人頭頸鱗狀細胞癌[7]、結直腸癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]、宮頸癌[11]、肺癌[12]、前列腺癌、黑色素瘤[13]、乳癌[14]、胰腺癌等。TLR4在乳癌組織中的表達尚少見報道。本研究結果顯示，乳癌組織TLR4表達明顯上調，其表達與腫瘤的組織學分級、T分期和ER、PR的狀態(tài)均有關。腫瘤的組織學分級越高，TLR4的表達率越高，TLR4可能參與了腫瘤的惡性進程，有可能成為腫瘤分化不良的重要標志，提示TLR4可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的惡性進程，進而影響病人預后。T2期TLR4的表達顯著高于T1期，說明TLR4可能促進腫瘤細胞的增殖，影響腫瘤的發(fā)展進程；ER陽性組TLR4的表達顯著高于ER陰性組；與PR陰性組比較，PR陽性組中TLR4的表達也有顯著增高。乳癌是一種雌激素依賴性腫瘤，研究表明，ER、PR與乳癌的組織分化和預后有密切聯(lián)系，ER、PR陽性往往預示著病人預后較好，而本研究中ER、PR陽性乳癌組織中TLR2和TLR4的表達明顯升高，與預期結果不符，這可能與我們收集的乳癌標本中ER、PR陰性例數(shù)太少有關，在后期的研究中需擴大標本例數(shù)做進一步研究。TLRs是近年來腫瘤免疫學的研究熱點。其促進腫瘤發(fā)生、侵襲轉移、復發(fā)、免疫逃逸的分子機制尚待進一步深入研究。TLRs在乳癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究尚少見報道，國內幾乎未見相關研究報道。

總之，本研究TLR2和TLR4在乳癌組織的表達結果提示，TLRs在乳癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的進程。TLR2和TLR4有望成為乳癌的預后判斷指標和新的治療靶點。對TLRs信號通路的分子機制進行深入研究，將為腫瘤生物治療提供新的策略，從而提高病人生存期和改善預后。

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