周璟明 陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周劍 方東升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

費(fèi)氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38胞外產(chǎn)新霉素的發(fā)酵條件優(yōu)化

周璟明 陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周劍 方東升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

旨在對(duì)Streptomyces fradiae FIM-S38胞外產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物新霉素進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。采用單因素篩選結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，探討搖瓶發(fā)酵的主要影響因子初始pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速等發(fā)酵參數(shù)的影響，確定了適宜發(fā)酵培養(yǎng)基組成和較佳發(fā)酵參數(shù)：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%，初始pH7.0，裝液量50 mL/500 mL，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，優(yōu)化后的發(fā)酵水平較原生產(chǎn)工藝提高了50%以上。

費(fèi)氏鏈霉菌 新霉素 正交設(shè)計(jì)法 發(fā)酵 優(yōu)化

新霉素（Neomycin）系由費(fèi)氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）［1］產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素［2，3］，是一種理想的干擾蛋白質(zhì)合成的殺菌劑［4］，臨床上主要用于治療胃腸道和呼吸道感染，同時(shí)新霉素能提高飼料的利用率，促進(jìn)禽畜生長，因此被廣泛地應(yīng)用于畜牧業(yè)，生產(chǎn)綠色食品［5，6］，近年來市場對(duì)新霉素的需求急劇增長。一些研究發(fā)現(xiàn)，新霉素能通過阻遏成纖維生長因子和內(nèi)皮生長因子來干擾血管的形成，可能發(fā)展成為抗癌藥物［7］，此外，還有研究發(fā)現(xiàn)新霉素具有巨大的抗HIV潛力［8］。目前國內(nèi)新霉素生產(chǎn)中普遍存在發(fā)酵過程復(fù)雜、周期長，發(fā)酵水平波動(dòng)性大，低產(chǎn)率高單耗等嚴(yán)重缺陷，優(yōu)良新霉素菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化已成為提高新霉素產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵途徑。本課題組前期對(duì)新霉素生產(chǎn)菌種Streptomyces fradiae SF1109進(jìn)行抗性篩選獲得一株新霉素的抗性基因突變高產(chǎn)菌Streptomyces fradiae FIM-S38，本研究擬對(duì)FIM-S38的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在為解決生產(chǎn)實(shí)際需要和提

高新霉素市場競爭力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 弗 氏 鏈 霉 菌Streptomyces fradiae FIM-S38，指示菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CPCC160020，由福建省微生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 斜面培養(yǎng)基 參照馬林等［9］報(bào)道的斜面培養(yǎng)基。

1.1.2.2 對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基 參照滕慧等［10］報(bào)道的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 根據(jù)試驗(yàn)方案改變培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，采用劃線法將培養(yǎng)好的菌種接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，34℃、220 r/min培養(yǎng)168 h，測定發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 效價(jià)檢測 參照《中國藥典》2010 版抗生素微生物檢定法（附錄XI A），效價(jià)為3次平均值，以相對(duì)值標(biāo)示。

1.2.2.2 菌體生長量測定 取10 mL發(fā)酵液于離心管中，3 500 r/min離心10 min，測得沉淀物在發(fā)酵液中的比例（Packed Mycelial Volume，PMV）即為菌絲濃度。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 碳源的影響

以無碳源的對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基，按3.0%的濃度分別添加糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、麥芽糖等各種碳源發(fā)酵FIM-S38，以3.0%糊精為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)新霉素的相對(duì)效價(jià)（Relative Titer，RT，%）為100，結(jié)果（表1）表明，碳源種類對(duì)新霉素產(chǎn)量的影響比對(duì)菌體生長大，F(xiàn)IM-S38菌濃度在13.5%-16.3%之間，可溶性淀粉和葡萄糖作為碳源時(shí)，產(chǎn)新霉素水平較高。因此選擇可溶性淀粉和葡萄糖作為復(fù)合碳源。

表1 碳源對(duì)Streptomyces fradiae FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.2 氮源的影響

用無氮源的對(duì)照培養(yǎng)基，按3.0%的濃度分別添加蛋白胨、麩質(zhì)粉、酵母粉、黃豆粉及玉米槳粉等各種氮源發(fā)酵FIM-S38，以3.0%蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)新霉素的相對(duì)效價(jià)為100。結(jié)果（表2）表明，氮源種類對(duì)新霉素產(chǎn)量和菌體生長均影響明顯，添加蛋白胨FIM-S38菌體PMV在13.5%，添加麩質(zhì)粉、酵母粉、黃豆粉及玉米槳粉，F(xiàn)IM-S38菌體 PMV在21.6%-30.8%之間，其中黃豆粉作為氮源時(shí)，產(chǎn)新霉素水平最高。因此選用3.0%黃豆粉作為氮源。

表2 氮源對(duì)Streptomyces fradiae FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.3 無機(jī)鹽的影響

在以3.0%黃豆粉為氮源的對(duì)照培養(yǎng)基中分別加入少量的無機(jī)鹽進(jìn)行單因子試驗(yàn)，以不加無機(jī)鹽發(fā)酵產(chǎn)新霉素的RT為100，結(jié)果（表3）顯示，培養(yǎng)基中添加微量金屬離子對(duì)FIM-S38菌體生長影響較小，其PMV在20.0%-23.5%之間，鐵、鎂、鈉、鋅、鈣鹽對(duì)FIM-S38合成新霉素均具有促進(jìn)作用，新霉素產(chǎn)量最高可達(dá)146.2。因此選擇硫酸鎂、碳酸鈣為培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽。

2.4 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇葡萄糖、可溶性淀粉、黃豆粉、硫酸鎂和碳酸鈣作為發(fā)酵培養(yǎng)基組成。正

交設(shè)計(jì)考察培養(yǎng)基各成分對(duì)產(chǎn)新霉素的影響，按表4所列因素和水平選用L16（45）表安排試驗(yàn)。結(jié)果（表5）顯示，以對(duì)照發(fā)酵產(chǎn)新霉素的相對(duì)效價(jià)為100，通過正交設(shè)計(jì)助手軟件分析，對(duì)產(chǎn)新霉素的影響主次順序?yàn)槠咸烟牵究扇苄缘矸郏军S豆粉＞碳酸鈣＞硫酸鎂，確定最佳組合為葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%。

表3 無機(jī)鹽對(duì)FIM-S38生長及合成新霉素的影響

表4 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 培養(yǎng)基初始pH值的影響

將優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)整至不同pH值進(jìn)行發(fā)酵。以初始pH7.0的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)新霉素的效價(jià)為100，結(jié)果（圖1）表明，F(xiàn)IM-S38對(duì)酸堿性環(huán)境均有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在初始pH3.0-11.0范圍內(nèi)菌體生長良好，酸性條件更利于菌體的繁殖，而在初始pH6.0-8.0范圍內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基最宜產(chǎn)新霉素，初始pH為7.0時(shí)新霉素產(chǎn)量最高。因此選擇培養(yǎng)基的初始pH為7.0。

圖1 初始pH值對(duì)FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.6 搖床轉(zhuǎn)速的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)基中考察FIM-S38在不同轉(zhuǎn)速下的發(fā)酵情況，以轉(zhuǎn)速250 r/min發(fā)酵產(chǎn)新霉素的效價(jià)為100。結(jié)果（表6）表明，搖床轉(zhuǎn)速在125-280 r/min之間時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，其新霉素產(chǎn)量亦提高，因此考慮搖床實(shí)際情況250 r/min的轉(zhuǎn)速較合適。

表6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)FIM-S38合成新霉素的影響

2.7 培養(yǎng)基裝液量的影響

對(duì)FIM-S38進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)基的不同裝液量發(fā)酵試驗(yàn)，以500 mL三角瓶裝液量50 mL發(fā)酵產(chǎn)新霉素的效價(jià)為100。結(jié)果（表7）表明，發(fā)酵水平隨裝量的增多而降低，在一定的裝量范圍內(nèi)通氣量與發(fā)酵水平呈正相關(guān)，說明該菌株對(duì)氧的需求較高，而發(fā)酵液裝量太少，蒸發(fā)量較大，發(fā)酵容積小，因此選擇50 mL/500 mL三角瓶為適宜裝液量。

表7 裝液量對(duì)FIM-S38合成新霉素的影響

2.8 發(fā)酵溫度的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，菌體生長、代謝、產(chǎn)素的酶活性受許多因素影響，其中培養(yǎng)溫度是一個(gè)重要影響因素。微生物有其最適和最耐受的溫度范圍，同一種微生物在不同的生長階段和不同的生理、生化過程中，最適溫度往往也不一樣。由表8可知，在上述確定的發(fā)酵條件下，以35℃發(fā)酵產(chǎn)新霉素的效價(jià)為100，在28-35℃時(shí)產(chǎn)量與溫度呈正相關(guān)，溫度為35℃ 時(shí)發(fā)酵產(chǎn)量最高，溫度提高到37℃時(shí)產(chǎn)量反而減少。因此在搖瓶培養(yǎng)過程中，35℃為菌體代謝最宜溫度。

表8 發(fā)酵溫度對(duì)FIM-S38合成新霉素的影響

2.9 菌體生長及生物合成新霉素的時(shí)間進(jìn)程

FIM-S38在上述確定的發(fā)酵條件下的發(fā)酵時(shí)間曲線（圖2）表明，在培養(yǎng)初期菌體大量生長而合成新霉素量少，在發(fā)酵48-72 h之后菌絲的生長發(fā)育即停止，但新霉素生物合成明顯增加，以120 h發(fā)酵產(chǎn)新霉素的效價(jià)為100，在144 h其效價(jià)達(dá)到最高峰，其發(fā)酵效價(jià)為136.4。

圖2 菌體生長及合成新霉素時(shí)間曲線

2.10 優(yōu)化發(fā)酵條件的驗(yàn)證

在原發(fā)酵條件和優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行5批次的發(fā)酵驗(yàn)證。以對(duì)照原發(fā)酵條件發(fā)酵產(chǎn)新霉素的RT為100，結(jié)果（表9）表明，優(yōu)化組發(fā)酵液中的發(fā)酵水平較對(duì)照組提高了57%、菌體生長量降低了8%，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了Streptomyces fradiae FIM-S38的優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果（n=5）

3 討論

改良微生物發(fā)酵參數(shù)，創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件，才能最大限度地發(fā)揮菌株的優(yōu)良性能提高產(chǎn)物產(chǎn)量，因此探索菌株高產(chǎn)特性充分表達(dá)的最佳培養(yǎng)條件是發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。由于Streptomyces fradiae FIM-S38系胞外產(chǎn)新霉素，在相同發(fā)酵水平下，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體濃度越低越有利于發(fā)酵液過濾和提取等后期處理，即菌體濃度低而發(fā)酵效價(jià)高的發(fā)酵條件是理想的選擇。因此采用正交設(shè)計(jì)法以發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量為指標(biāo)對(duì)新霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方中各組分的含量進(jìn)行優(yōu)化，篩選獲得了適宜發(fā)酵培養(yǎng)基組成和較佳發(fā)酵參數(shù)，其菌體生長良好而菌濃度明顯減少，同時(shí)新霉素產(chǎn)量顯著提高。通過在綜合最優(yōu)條件下的5批搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，證實(shí)優(yōu)化發(fā)酵條件下FIM-S38的發(fā)酵水平明顯優(yōu)于對(duì)照，其發(fā)酵液中新霉素產(chǎn)量顯著提高。

新霉素原發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分多，培養(yǎng)液中存在大量不溶性顆粒，配制過程復(fù)雜，致使生產(chǎn)易染菌，成本高。在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方中，以單一氮源代替原生產(chǎn)工藝培養(yǎng)基中的多種氮源，配制簡便，同時(shí)添加少量的鎂、鈣鹽提高了菌體的代謝能力和目標(biāo)產(chǎn)物的合成能力，通過條件優(yōu)化發(fā)酵周期由原工藝的168 h 縮短到144 h，提高了產(chǎn)素率，若應(yīng)用到幾十噸乃至上百噸生產(chǎn)發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，將會(huì)大大降低生產(chǎn)成本，增加產(chǎn)量，具有較強(qiáng)的市場競爭力。通過對(duì)弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae FIM-S38發(fā)酵過程控制研究，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)氧的需求量較大，在生產(chǎn)工藝方面還有進(jìn)一步改進(jìn)提高的潛力，如生長因子、表面活性劑及其添加時(shí)間對(duì)生物合成目標(biāo)產(chǎn)物的影響等，均有待深入的研究。

4 結(jié)論

通過對(duì)Streptomyces fradiae FIM-S38胞外產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物新霉素進(jìn)行發(fā)酵條件研究，采用單因素篩選結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，同時(shí)單因素試驗(yàn)考察搖瓶發(fā)酵參數(shù)，如初始pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速等主要影響因子的影響，確定了適宜發(fā)酵培養(yǎng)基組成和較佳發(fā)酵參數(shù)：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%，初始pH7.0，裝液量50 mL/500 mL，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，優(yōu)化后的發(fā)酵水平較原生產(chǎn)工藝提高了50%以上。

［1］Rinehart KL Jr, Stroshane RM. Biosynthesis of aminocyclitol antibiotics［J］. Journal of Antibiotics, 1976, 29（4）：319-353.

［2］Huang F, Spiteller D, Koorbanally NA, et al. Elaboration of neosamine rings in the biosynthesis of neomycin and butirosin［J］. Chembiochem, 2007, 8（3）：283-288.

［3］Waksman SA, Lechevalier HA. Neomin, a new antibiotic active streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis organisns［J］. Science, 1949, 109（3）：305-307.

［4］Mehta R, Champney WS. Neomycin and paromomycin inhibit 30S ribosomal subunit assemblyin Staphylococcus aureus［J］. Current Microbiology, 2003, 47（3）：237-243.

［5］沈川, 肖希龍.新霉素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留及其測定方法［J］.中國獸醫(yī)雜志, 1998, 32（2）：253-256.

［6］管玉霞, 劉志瓊.一種提高新霉素產(chǎn)素率新方法的初步研究［J］.產(chǎn)業(yè)與科技論壇, 2007, 6（7）：89-90.

［7］滕慧, 張亞雄.新霉素研究進(jìn)展［J］.三峽大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2008, 30（2）：95-98.

［8］顧覺奮, 陳麗萍.新霉素A、B及其衍生物抗HIV作用的研究［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊, 2008, 29（4）：154-159.

［9］馬林, 達(dá)娃, 劉運(yùn), 等.費(fèi)氏鏈霉菌中子輻射誘變菌株對(duì)新霉素的生物轉(zhuǎn)化［J］.微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37（9）：1347-1355.

［10］滕慧, 張亞雄.復(fù)合誘變選育新霉素高產(chǎn)菌株的研究［J］.中國釀造, 2008, 13（7）：37-39.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Conditions for Neomycin-producing Strain Streptomyces fradiae FIM-S38

Zhou Jingming Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jian Fang Dongsheng
（Fujian Institute of Microbiology，F(xiàn)uzhou 350007）

It was to optimize the fermentation conditions of neomycin producing by Streptomyces fradiae FIM-S38. The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation medium and conditions of FIM-S38 in shake flasks. The constituents of medium, the filling volume of shaking flask, the rotation speed and the temperature were the major factors that affected the yield of neomycin. The composition of glucose 6.0%, soluble starch 3.5%, soybean meal 2.0%, MgSO40.1% and CaCO30.3% was selected to be the medium formula, and the optimal fermentation parameters were as follows：the filling volume 50 mL for a 500 mL shake flask, initial pH at 7.0, shaker’s rotating speed 250 r/min, temperature 35℃, fermentation time 6 d, and the titer of neomycin was 50% higher than that in control.

Streptomyces fradiae Neomycin Orthogonal experiment Fermentation Optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.015

2014-05-28

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01094）

周璟明，女，碩士，助理研究員，研究方向：微生物藥物；E-mail：15752437@qq.com

張祝蘭，研究員，研究方向：微生物藥物；E-mail：jessylan9963@sina.com