阮征李杰劉開武王蓮芳華娟胡小明劉杰，黃海軍，4

（1. 武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4. 武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

PRRS病毒主要受體蛋白CD151和CD163真核表達(dá)載體的構(gòu)建

阮征1，2李杰1劉開武2王蓮芳1華娟1胡小明3劉杰1，3黃海軍1，4

（1. 武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4. 武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

為了進(jìn)一步研究PRRSV 與細(xì)胞受體之間的相互作用機(jī)理，通過基因工程方法從PAM 細(xì)胞中克隆獲得了CD151和CD163 全長編碼片段，利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對回收得到的CD151（762 bp）和CD163（3 333 bp）DNA片段進(jìn)行酶切，構(gòu)建了pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163真核表達(dá)載體。經(jīng)PCR 和酶切鑒定后，分別提取重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡下可見單獨轉(zhuǎn)染CD151和CD163基因或CD151/CD163共轉(zhuǎn)染的Marc 145細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光，Western blot分析結(jié)果進(jìn)一步證實，CD151和CD163蛋白在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中獲得超表達(dá)。豬CD151和CD163 真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染細(xì)胞過程中的協(xié)同作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是對深入研究PRRS病毒的入侵及宿主識別具有重要意義。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 CD151分子 CD163分子 真核表達(dá)載體 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬群中流行的重要傳染病之一，病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），

可引起母豬的繁殖障礙（包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等）、仔豬成活率急劇下降和育成豬呼吸道疾病［1-3］。PRRSV有嚴(yán)格的宿主和細(xì)胞嗜性，需要首先與細(xì)胞受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)完成病毒的脫殼與基因組釋放［4-6］。

目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV感染相關(guān)受體有唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素、CD163分子、CD151分子和波形蛋白［8-11］。有關(guān)研究結(jié)果表明PAM細(xì)胞表面存在唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素兩種PRRSV相關(guān)受體，在PRRSV感染巨噬細(xì)胞過程中主要起幫助黏附、內(nèi)化的作用［7］；而在Marc-145細(xì)胞中波形蛋白起到PRRSV受體作用；CD151能與PRRSV 3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)（3'URT）發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PRRSV與細(xì)胞發(fā)生相互作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生感染。通過轉(zhuǎn)染使PRRSV非敏感細(xì)胞BHK-21表達(dá)CD151會使該細(xì)胞允許PRRSV的感染，增殖程度高達(dá)100倍［8］。CD163為一種SRCR超家族的Hapten Hemoglobin清道夫受體，是130 000的細(xì)胞表面糖蛋白，在PRRSV感染巨噬細(xì)胞過程中介導(dǎo)病毒在細(xì)胞質(zhì)中的脫衣殼和病毒基因組的釋放［9-11］。

本研究通過構(gòu)建豬CD151和CD163 真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染細(xì)胞過程中的協(xié)同作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是對深入研究PRRS病毒的入侵及宿主識別具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳育種與繁殖農(nóng)業(yè)部重點實驗室提供。豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院胡小明博士惠贈。

限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit、Plasmid mini preps Kit均購自華美生物工程公司。脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司。pMD18-T購自TaKaRa公司。載體pIRES2-EGFP購自BD Biosciences Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank報道的豬CD151（NM_001243865.1）和CD163（NM_213976.1）基因序列，以此為模板，利用primer premier 6及Oligo 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計（表1）。引物由上海生物工程公司合成。

表1 豬CD151和CD163基因cDNA擴(kuò)增的引物序列

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 利用提取的豬PAM細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA為模板，表1中的CDS全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用KOD DNA聚合酶，PCR反應(yīng)體系為50 μL體系，其中包括ddH2O 10 μL，dNTPs 8 μL（濃度為10 mmol/L），2×Buffer 25 μL，cDNA模板4 μL，上下游引物分別添加1 μL KOD DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火30 s，68℃延伸 40 s，35個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，利用G-BOX凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 目的片段的回收、酶切和純化 按照DNA膠回收試劑盒（Axygen，USA）說明書操作程序回收目的DNA。利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對回收得到的CD151（762 bp） 和CD163（3 333 bp）DNA片段進(jìn)行雙酶切（20 μL體系）：1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 14 μL，Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。在37℃恒溫箱中酶切5 h之后，再用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，純化得到的產(chǎn)物可用于下一步的連接。

1.2.4 載體酶切、回收和連接 利用Sal I和Kpn I內(nèi)切酶對空載體pIRES2-EGFP進(jìn)行雙酶切，酶切體系（20 μL）如下：體系：ddH2O 10 μL，1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 4 μL（2 μg），Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。酶切之后，利用膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行回收。最后將得到的線性載體與目的基因DNA進(jìn)行連接（20 μL）：ddH2O 9 μL，buffer 2 μL，DNA 6 μL（0.3 pmol），Vector 2 μL（0.03 pmol），T4 ligase 1 μL。在4℃連接反應(yīng)過夜。

1.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 無菌條件下，在100 μL的感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μL連接產(chǎn)物，混勻后冰

浴30 min。然后42℃水浴熱擊90 s，迅速冰浴1-2 min。每管加400 μL LB培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇60 min。5 000 r/min離心6 min，棄上清400 μL，剩余的涂布至含100 μg/mL Kan的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12-16 h至單菌落出現(xiàn)。

1.2.6 PCR檢測陽性菌 挑取平板上的單菌落于3 mL（含100 μg/mL的Amp）LB培養(yǎng)基中，37℃300 r/min振搖培養(yǎng)過夜。取1 μL菌液作模板進(jìn)行PCR檢測。檢測陽性后送武漢擎科測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank序列一致的菌液可以直接擴(kuò)大培養(yǎng)，提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.2.7 超純質(zhì)粒提取 采用Omega公司Endo-free Plasmid Mini Kit II試劑盒提取質(zhì)粒并將得到的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對酶切片段進(jìn)行初步驗證。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western blot分析 按照Invitrogen公司脂質(zhì)體2000的使用說明書，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD151、pIRES2-EGFP-CD163轉(zhuǎn)染到6孔板上處于對數(shù)生長期的Marc 145細(xì)胞，無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，并收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 CD151和CD163基因的PCR擴(kuò)增

利用PCR方法從豬PAM細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增CD151和CD163基因，電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期的結(jié)果相符，C151為762 bp，CD163為3 333 bp（圖1）。測序結(jié)果表明，克隆的CD151和CD163基因片段均含有該基因完整的編碼區(qū)序列，也包含信號肽序列。

圖1 目的基因DNA片段電泳結(jié)果

2.2 pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163重組質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒用Sal I和Kpn I進(jìn)行雙酶切，可以分別得到約5.3 kb、762 bp片段和5.3 kb、3 300 bp片段（圖2），進(jìn)一步證實了陽性重組質(zhì)粒。測序結(jié)果經(jīng)Blast軟件比對分析，上述結(jié)果與NCBI公布序列一致（含信號肽編碼區(qū)），表明構(gòu)建載體成功。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western blot分析結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光表達(dá)（圖3）。Western blot結(jié)果（圖4）表明，與對照組（未轉(zhuǎn)染組）相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單一受體蛋白或CD151、CD163共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平均高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，共轉(zhuǎn)染組較單一轉(zhuǎn)染組同一目的蛋白表達(dá)水平略低。

3 討論

PRRSV 侵染靶細(xì)胞的先決條件是實現(xiàn)與宿主細(xì)胞的吸附，而宿主細(xì)胞表面的受體是完成這種吸附過程必不可少的［12，13］。研究發(fā)現(xiàn)，CD151分子無論是在體外還是體內(nèi)都能與PRRSV的3'非編碼區(qū)相結(jié)合，猴抗CD151多克隆抗體可以完全阻斷PRRSV對MARC-145細(xì)胞的感染［14］。同時，CD15l分子在PRRSV易感細(xì)胞（如PAM、MARC-145、MA-104）中廣泛存在，而在BHK、MDBK等不敏感細(xì)胞中不表達(dá)［14］，說明CDl51在PRRSV體外研究中扮演著重要角色。大量研究表明，豬肺泡巨噬細(xì)胞上的CD163分子可以使PRRSV非允許細(xì)胞系PK-15獲得感染PRRSV并產(chǎn)生子代病毒粒子的能力。表明

CD163分子不僅可以介導(dǎo)病毒的吸附，還可以介導(dǎo)PRRSV的復(fù)制產(chǎn)生子代病毒，是PRRSV感染PAM細(xì)胞必不可少的受體分子［15-17］。因此，本研究將CD151和CD163作為研究對象，進(jìn)行真核表達(dá)載體構(gòu)建。

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

圖4 Western blot 分析結(jié)果

在構(gòu)建載體的過程中采用pIRES2-EGFP雙基因表達(dá)載體，該載體帶有的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）編碼基因，是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強(qiáng)35倍［18］，大大增強(qiáng)了其報告基因的敏感度，且熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性強(qiáng)，目前得到廣泛應(yīng)用。pIRES2-EGFP還含有CMV強(qiáng)啟動子和SV40 poly A加尾信號，前者可增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，后者可增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄效率。該載體還攜帶新霉素抗性基因，提供了G418篩選的標(biāo)志，便于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選。本研究將編碼CD151和CD163的 cDNA插入到表達(dá)熒光蛋白的pIRES2-EGFP的多克隆位點處，通過轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和單酶切、雙酶切鑒定，成功地構(gòu)建了含有CD151和CD163目的基因和熒光蛋白報告基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163。它的應(yīng)用可以使轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時表達(dá)目的蛋白和綠色熒光蛋白，所以它不僅能導(dǎo)入外源性目的基因，而且可利用熒光蛋白的表達(dá)對轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行直觀、及時地觀察和檢測。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了 PRRSV 感染細(xì)胞過程中的兩個重要的受體CD151和CD163的全長編碼區(qū)域，包含了起始密碼子、終止密碼子和信號肽。信號肽的存在保證了表達(dá)產(chǎn)物正常分泌到胞外。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的豬CD151和CD163基因真核表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定、序列分析完全正確，為進(jìn)一步研究PRRSV兩個最重要的受體 CD163 和CD151在其感染過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，有助于了解 PRRSV 侵入的過程，揭示 PRRSV 感染靶細(xì)胞的分子機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for the CD151 and CD163 Receptor Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Ruan Zheng1，2Li Jie1Liu Kaiwu2Wang Lianfang1Hua Juan1Hu Xiaoming3Liu Jie1，3Huang Haijun1，4
（1 .Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics，Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and Reproduction（Huazhong Agricultural University），Ministry of Education，Wuhan 430070；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）

In order to study the interaction mechanism between the PRRSV and cell receptors, the CD151 and CD163 code fragments were obtained from PAM cells by PCR. These PCR products were digested with Sal I and Kpn I, then inserted into pIRES2-EGFP vectors separately to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2 EGFP - CD151 or pIRES2 EGFP - CD163. These vectors were identified by the methods of restriction enzyme digestion, PCR and sequencing. Marc 145 cells transfected with CD151 or CD163 or CD151/CD163 expressed strong green fluorescence, which was further confirmed by western blot. The successful establishment of eukaryotic expression vectors of CD151 and CD163 provides the material foundation for the further exploring the synergistic effect of CD151 and CD163 in the process of PRRSV infection, especially to the further study of PRRS virus invasion and the host identification.

Porcine reproductive and respiratory syndrome CD151 CD163 Eukaryotic expression vector Cell transfection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.032

2014-09-22

國家自然科學(xué)基金項目（31201938），武漢市科技局項目（2013020705070350-9，2013020705070350-14），武漢市農(nóng)科院創(chuàng)新項目（CX201309），武漢市農(nóng)科院青年英才項目（YC201101）

阮征，男，學(xué)士，高級獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控；E-mail：paper2006@sina.cn

黃海軍，男，博士，高級畜牧師，研究方向：動物生物技術(shù)與疫病防控；E-mail：hygene@qq.com