牟寬厚 周 艷韓 丹 穆 欣

·論著·

苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL的調(diào)控

牟寬厚 周 艷?韓 丹 穆 欣

目的: 明確苦參堿對(duì)HaCaT細(xì)胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL表達(dá)的影響。方法: 體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，選擇第二代細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞作為研究對(duì)象，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:苦參堿2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL 3組及對(duì)照組(加入相同體積的0.9%鹽水)，孵育48 h后，MTT法測定各濃度下細(xì)胞增殖，RT－PCR檢測Bcl－2/Bax和Fas/FasL的表達(dá)。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，當(dāng)苦參堿濃度為2 mg/m L時(shí)，HaCaT細(xì)胞增殖活性無明顯變化；Bcl－2、Bax、Fas、FasL表達(dá)也無明顯變化(P＞0.05)。當(dāng)苦參堿濃度為10mg/mL時(shí)HaCaT細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組明顯下降(P＜0.001)；Bcl－2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)上升(P＜0.001)；Fas、FasL表達(dá)上升(P＜0.05)。當(dāng)苦參堿濃度為50mg/mL時(shí)，MTT法檢測HaCaT細(xì)胞增殖明顯抑制(P＜0.001)；同時(shí)Bcl－2、Bax、Fas和FasL的變化與10mg/mL時(shí)相似(P＞0.05)。結(jié)論: 苦參堿能夠調(diào)控上皮細(xì)胞致炎因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖。

苦參堿； HaCaT細(xì)胞； 實(shí)時(shí)定量PCR； Bcl－2/Bax； Fas/FasL

正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡速度是相同的，但在銀屑病中存在多種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常，最終造成銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失常，其中以Bcl－2/Bax及Fas/FasL較為重要。維A酸類藥物對(duì)銀屑病有效但無法控制銀屑病的復(fù)發(fā)，在以往的研究中，我們?cè)噷⒕SA酸類藥物與苦參素(苦參堿)合并應(yīng)用，取得良好效果，1且患者可以維持較長的緩解期，為了進(jìn)一步證實(shí)苦參堿的有效性，我們正在嘗試在臨床上單用苦參堿來治療尋常型銀屑病，小樣本的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了滿意的療效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和器材 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)(第四軍醫(yī)大學(xué)皮膚實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))，并由本實(shí)驗(yàn)室保存；1640培養(yǎng)基(GIBCO)；苦參堿注射液(正大天晴)；四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(Sigma)；TRIzol法總RNA抽提試劑盒(Invitrogen，USA)；PCR引物(北京奧克公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKa-Ra，日本)；5－Target qPCR Kit(BIO－RAD，USA)；cDNA試劑盒(Fermentas，加拿大)；內(nèi)參采用β－actin；鼠抗人角蛋白單克隆抗體(AE1/AE3)(Santa Cruz)。

1.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞復(fù)溫，采用鼠抗人單克隆抗體鑒定證實(shí)。復(fù)溫后的HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含100 U/m L青霉素，100 U/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶－0.05% EDTA 37℃5 min消化傳代，吸管輕輕吹打；在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓回縮時(shí)用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞重新懸??；以1∶3進(jìn)行傳代。

1.3 HaCaT細(xì)胞的傳代 當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)原有的培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗2遍。加入預(yù)熱至37℃的0.25%胰酶－0.05%EDTA，搖勻后放置37℃孵育箱孵育5 min，并在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)由多角形回縮至卵圓形時(shí)，快速加入預(yù)熱至37℃的含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液胰酶終止消化，反復(fù)吹打，使細(xì)胞脫落并散開。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min離心5min。棄去上清液，再次用預(yù)熱至37℃的含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，并將這些細(xì)胞懸液分裝至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將增殖到80%～90%的細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行研究。

1.4 MTT測定細(xì)胞增殖活性 將上述細(xì)胞重新消化隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別接種于24孔培養(yǎng)板，每3孔為1組，每孔加入1×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組以苦參堿2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL梯度濃度分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔中；對(duì)照組加入等量的0.9%氯化鈉注射液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后每孔加入20μLMTT溶液(濃度為5 g/L、PBS稀釋)，37℃繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10min，選擇490 nm波長，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值(A值)，結(jié)果以統(tǒng)計(jì)圖表記錄。

1.5 細(xì)胞收集 將上述1.3細(xì)胞重新消化隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別接種于24孔培養(yǎng)板，每3孔為1組，每孔加入1×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組以苦參堿2 mg/m L、10 mg/mL和50 mg/mL濃度分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔中；對(duì)照組加入等量的0.9%氯化鈉注射液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將上述各組細(xì)胞分別消化離心，收取沉淀的細(xì)胞。

1.6 RT－PCR檢測Bcl－2、Bax、Fas、FasL 將以上收集的不同組別細(xì)胞分別用液氮在研缽中研磨成粉末；移入玻璃勻漿器加入1 m L TRIzol抽打勻漿；按照標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行RNA抽提；取樣品1μg，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)基因庫序列設(shè)計(jì)Bcl－2、Bax、Fas、FasL引物(表1)，建立RT－PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用SYBR Green I熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以β－肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算機(jī)分析Ct值，用以評(píng)定各因子mRNA的表達(dá)水平。待測樣品相對(duì)值＝2－[△Ctβ－肌動(dòng)蛋白－△C(t)待測樣品]。

表1 RT－PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0和Prism科學(xué)繪圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 見圖1。當(dāng)苦參堿濃度為2 mg/m L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A值與對(duì)照組比較無明顯變化(P＞0.05)；當(dāng)苦參堿濃度為10 mg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A值與對(duì)照組比較下降明顯(P＜0.001)；當(dāng)苦參堿濃度為50 mg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A值與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.001)，與10 mg/mL組無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 MTT法檢測不同濃度下HaCaT細(xì)胞增殖情況

2.2 RT－PCR檢測結(jié)果 見圖2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，當(dāng)苦參堿濃度為2 mg/m L時(shí)，HaCaT細(xì)胞表達(dá)Bcl－2、Bax、Fas及FasL與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)；當(dāng)苦參堿濃度為10 mg/m L時(shí)，Bcl－2表達(dá)明顯下降(P＜0.001)；Bax表達(dá)顯著升高(P＜0.001)；Fas表達(dá)升高(P＜0.05)；FasL表達(dá)升高(P＜0.01)。當(dāng)苦參堿濃度為50mg/mL時(shí)Bcl－2、Bax、Fas及FasL變化同10 mg/m L組，但FasL變化更明顯(P＜0.001)，兩組濃度間比較無明顯差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說明:苦參堿在低濃度時(shí)對(duì)Bcl－2、Bax、Fas及FasL表達(dá)無顯著影響。而當(dāng)其濃度為10 mg/mL時(shí)上述細(xì)胞因子檢測水平均出現(xiàn)明顯變化，但這種變化并不隨濃度的增加而增加。

圖2 苦參堿各濃度下HaCaT細(xì)胞Bcl－2、Bax、Fas及FasL的表達(dá)

3 討論

銀屑病組織病理顯示角化過度，角化不全，真皮乳頭血管彎曲擴(kuò)張，表皮角質(zhì)層或顆粒層內(nèi)可見Munro微膿瘍。臨床可以看到患者皮損區(qū)細(xì)胞大量脫落，細(xì)胞更新增速。有研究報(bào)道這種改變可能與某些基因異常表達(dá)有關(guān)。2Bcl－2/Bax，F(xiàn)as/FasL的表達(dá)失衡可能通過增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞活性、產(chǎn)生致炎因子和免疫功能紊亂進(jìn)而造成銀屑病發(fā)生。3

苦參堿來自苦參，從中醫(yī)理論來講苦參味苦，性寒，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)。銀屑病急性發(fā)作和進(jìn)展期往往表現(xiàn)為血熱和血燥，苦參正是通過清熱涼血來治療銀屑病。近年來西醫(yī)認(rèn)為苦參的藥理作用主要由苦參堿來完成?？鄥A能夠影響上皮細(xì)胞某些基因的表達(dá)，調(diào)控致炎因子的水平，還能發(fā)揮免疫抑制作用并表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。4在本課題研究中，我們觀察到苦參堿可以抑制HaCaT細(xì)胞增殖，且對(duì)HaCaT細(xì)胞某些基因表達(dá)具有顯著影響，它可能通過上調(diào)Bax、Fas及FasL，下調(diào)Bcl－2發(fā)揮作用，也有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿顯著影響免疫細(xì)胞及增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞中上述基因的表達(dá)，甚至具有良好的抗病毒作用，對(duì)于急性感染相關(guān)的點(diǎn)滴狀銀屑病治療效果可能更好。5－7

1牟寬厚，馬慧群.阿維A聯(lián)合苦參素治療尋常型銀屑病的臨床療效觀察.中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24(3):292－294.

2 Batinac T，Zamolo G，Hadzisejdic I，et al.Expression of Bcl－2 fam ily proteins in psoriasis.Croatian Med J，2007，48(3):319－326.

3 Yan C，Mc Cormick T，Cooper K.Activated interferon－gamma＋T cell caspase induction and decreased Bcl－2/Bax ratio may confer increased susceptibility to anti－Fas and ultraviolet B treatment.J Invest Dermatol，2005，124(4):129.

4何雄，韋星船，田裕昌，等.苦參堿及其衍生物合成及生物活性研究進(jìn)展.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28(9):816－823.

5劉占術(shù)，陳建斌，湯為學(xué)，等.苦參堿對(duì)Raji細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL表達(dá)的影響.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30 (22):2561－2564.

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7 Shin MS，Kim SJ，Kim SH，et al.New onset guttate psoriasis following pandemic H1N1 Influenza vaccination.Ann Dermatol，2013，25(4):489－492.

(收稿:2013－11－20 修回:2014－02－14)

Regulation of Bcl－2/Bax and Fas/FasL by matrine in HaCaT cells

MOU Kuan-hou，ZHOU Yan，HAN Dan，et al.Department ofDermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xian，710061

Objective:To determine the effect ofmatrine on Bcl－2/Bax and Fas/FasL in keratinocytes in vitro.Methods:Second generation cultured HaCaT cells(logarithmic phase cells)were selected and divided into 4 groups:3 matrine groups(2mg/m L，10mg/m L and 50mg/mL were used in each group)and the control group(0.9%Natrii Chloride).After 48－h(huán)our culture，the proliferation of HaCaT were detected by MTT and the levels of Bcl－2/Bax and Fas/FasLweremeasured by RT－PCR.Results:The viability of HaCaT cells was similar in 2mg/mLmatrine group and control group(P＞0.05).In 10mg/mLmatrinegroup the proliferation of the cellswas significantly decreased(P＜0.001)and the Bcl－2 expression was remarkably reduced(P＜0.001)，while the expression of Bax，F(xiàn)as and FasL was significantly increased(P＜0.01 and P＜0.05，respectively).When the concentration ofmatrine was increased to 50mL，the viability and the expression of Bcl－2，Bax，F(xiàn)asand FasLwas sim ilar to the resultswhen 10mLmatrine was used.Conclusion:Matrine can inhibit HaCaT cells proliferation(at 10 mg/mL or more)and may adjust expression of Bcl－2/Bax and Fas/ FasL in HaCaT cells.

marine；HaCaT cells；Real－time quantitative PCR；Bcl－2/Bax；Fas/FasL

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):2009k13－02)

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，710061

?通信作者