李湧，余巍，馬燕娟，趙永鋒，楊健，劉軍義，鄭玲，*

（1.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣西南寧530021；2.桂林聚果園果汁有限公司，廣西桂林541000）

涼粉草中天然有機(jī)酸化學(xué)成分的研究

李湧1，余巍1，馬燕娟1，趙永鋒1，楊健2，劉軍義1，鄭玲1，*

（1.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣西南寧530021；2.桂林聚果園果汁有限公司，廣西桂林541000）

通過堿性溶液提取、高效液相色譜分離測(cè)定，在植物涼粉草中分離鑒定出一種新的天然有機(jī)酸成分-苯甲酸。樣品經(jīng)處理后，使用3種不同的色譜柱，在不同的色譜條件下，均呈現(xiàn)出與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時(shí)間，待測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)苯甲酸的光譜圖也完全相符，證實(shí)了植物涼粉草中天然苯甲酸的存在。本方法首次利用高效液相色譜法對(duì)植物涼粉草中的天然有機(jī)酸化學(xué)成分-苯甲酸進(jìn)行分離鑒定?？蔀槠渌参镏刑烊挥袡C(jī)酸化學(xué)成分的鑒定提供參考。

涼粉草；苯甲酸；高效液相色譜

涼粉草（Mesona chinensis Benth），別名仙人草、仙人凍、薪草、仙草，為唇形科涼粉草屬一年生草本植物[1]。在中國主產(chǎn)于南方各省及臺(tái)灣南部，印尼和越南也有廣泛分布和較大產(chǎn)量。2010年3月，國家衛(wèi)生和計(jì)劃委員會(huì)發(fā)布[2010年]第3號(hào)公告，允許涼粉草（仙草Mesona chinensis Benth.）作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營[2]，涼粉草被列入中國藥食同源植物目錄。

涼粉草作為重要的藥用和食用植物資源，含有豐富的營養(yǎng)成分、具有特殊的醫(yī)療功效，是天然、安全、保健、營養(yǎng)食品較理想的原料，其加工利用價(jià)值非常廣泛，近年來發(fā)展規(guī)模不斷擴(kuò)大。由涼粉草為主要原料制成的仙草凍和龜苓膏等中式傳統(tǒng)甜點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者喜歡，在華南、港臺(tái)區(qū)域及東南亞國家很流行；市面上流行的包裝涼茶飲料品牌，例如王老吉、加多寶、和其正、楊協(xié)成及晨光等品牌涼茶飲料配料表中都含有仙草成分，對(duì)涼粉草的研究已成為熱點(diǎn)。

研究顯示，涼粉草中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、色素、酚類、三萜酸、黃酮、多糖等營養(yǎng)成分，同時(shí)含有鈣、鋅、鐵、錳、鉀等礦物質(zhì)元素[3]。對(duì)涼粉草中黃酮類、多糖、三萜類、色素、揮發(fā)油等[4-8]已有較深入研究，但未見對(duì)涼粉草中天然有機(jī)酸化學(xué)成分的研究。

苯甲酸作為一種天然有機(jī)酸化合物，在自然界植物成分中廣泛分布，是植物的活性成分之一[9]，例如半夏、馬齒莧、紅芽大戟、白蒺藜、板藍(lán)根[10-14]等中藥材中均含有天然苯甲酸成分。有文獻(xiàn)[15]報(bào)道：板藍(lán)根中含有的苯甲酸等有機(jī)酸成分具有有較強(qiáng)抗內(nèi)毒素活性。

本文采用高效液相色譜法對(duì)涼粉草提取物進(jìn)行分離測(cè)定，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，證明在涼粉草中天然含有微量有機(jī)酸——苯甲酸，對(duì)涼粉草食療機(jī)理深入研究和資源進(jìn)一步科學(xué)開發(fā)利用具有積極意義。

1 材料

1.1 原料和試劑

干涼粉草（全草）：購自廣西靈山縣。當(dāng)年產(chǎn)，無病害，經(jīng)除雜、清洗、晾干、切段、粉碎和過篩后備用。

標(biāo)準(zhǔn)品：苯甲酸（1.00mg/L），購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器DAD）：美國Agilent公司；Milli-Q Reference超純水器：美國Millipore公司；PHS-3C型精密PH計(jì)：上海雷磁儀器廠；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Anke DL-5-B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法

2.1 提取方法

稱取0.50 g涼粉草試樣，置于50mL離心管中。加入0.6%氫氧化鈉溶液30mL，混勻，浸泡30min，再于40℃超聲提取40min，4 000 r/min離心10min，得提取液。

取提取液10mL，加入6mol/L的鹽酸溶液1mL，混勻，用10mL乙醚超聲提取20min，4 000 r/min離心，將乙醚層轉(zhuǎn)移至25mL刻度試管中，殘?jiān)儆?0mL乙醚同前提取1次，合并提取液，定容至20mL。加入1mL酸性氯化鈉溶液，振搖2min，離心，取5mL乙醚提取液于40℃氮?dú)獯蹈?，?mL水定容，過0.45μm濾膜，得測(cè)試液。

2.2 分析方法

將測(cè)試液分別采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）、ZORBAX SB-Aq（5μm，4.6mm i.d.×250mm）和Poroshell 120 EC-C18（2.7μm，4.6mm i.d.×100mm）3種色譜柱進(jìn)行測(cè)定，并與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照。其余條件為：流動(dòng)相：V（甲醇)：V（20mmol/L的乙酸銨溶液）=5∶95；流速：1mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長：230 nm。

分別以5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25∶75；30∶70的V（甲醇)：V（20mmol/L的乙酸銨溶液）為流動(dòng)相對(duì)測(cè)試液進(jìn)行測(cè)定，并與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照。其余條件為：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）；其它條件同上。

利用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定測(cè)試液中與標(biāo)準(zhǔn)苯甲酸保留時(shí)間一致的化合物的光譜圖，并與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同色譜柱的分析研究

高效液相色譜作為廣泛使用的分離測(cè)定方法，對(duì)未知化合物的定性一般必須使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照。如化合物峰與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰的保留時(shí)間一致，則可認(rèn)為該化合物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相同。本研究將待測(cè)溶液分別采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）、ZORBAX SB-Aq（5μm，4.6 mm i.d.×250 mm）和Poroshell 120 EC-C18（2.7μm，4.6mm i.d.×100mm）3種色譜柱進(jìn)行測(cè)定，并與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示，在分離良好的情況下，待測(cè)溶液中均有與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間一致的峰，因此，可確定該待測(cè)溶液中含有苯甲酸。在各色譜柱上的分離的液相色譜圖見圖1、圖2和圖3。

圖1 在ZORBAX Eclipse XDB-C18柱的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms on ZORBAX Eclipse XDB-C18

圖2 在ZORBAX SB-Aq柱的液相色譜圖Fig.2 Chromatograms on ZORBAX SB-Aq

圖3 在Poroshell 120 EC-C18柱的液相色譜圖Fig.3 Chromatograms on Poroshell 120 EC-C18

3.2 不同比例流動(dòng)相的分析研究

在使用液相色譜測(cè)定樣品時(shí)，如遇到較復(fù)雜樣品，單一的流動(dòng)相條件不能對(duì)其進(jìn)行定性的時(shí)候，通常通過改變流動(dòng)相的比例重新測(cè)定。流動(dòng)相的比例不同，洗脫能力不同，則化合物的保留時(shí)間也會(huì)改變。改變流動(dòng)相比例，如待測(cè)物保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不一致，則可判定不是同一種物質(zhì)；反之，無論流動(dòng)相比例如何變動(dòng)，保留時(shí)間始終與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相同，則可判定為同一種物質(zhì)。本研究采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（5μm，4.6mm i.d.×250mm）色譜柱，分別以5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25∶75；30∶70的V（甲醇）∶V（20mmol/L的乙酸銨溶液）為流動(dòng)相對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行測(cè)定，并與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示，在各不同比例的流動(dòng)相條件下，均有與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間一致的峰，因此，可確定該待測(cè)溶液中含有苯甲酸。在不同流動(dòng)相比例下的色譜圖見圖4～圖9。

圖4 流動(dòng)相比例為5∶95時(shí)的液相色譜圖Fig.4 Chromatograms at Mobile phase ratio is5∶95

圖5 流動(dòng)相比例為10∶90時(shí)的液相色譜圖Fig.5 Chromatograms at Mobile phase ratio is10∶90

圖6 流動(dòng)相比例為15∶85時(shí)的液相色譜圖Fig.6 Chromatograms at Mobile phase ratio is15∶85

圖7 流動(dòng)相比例為20∶80時(shí)的液相色譜圖Fig.7 Chromatograms at Mobile phase ratio is20∶80

圖8 流動(dòng)相比例為25∶75時(shí)的液相色譜圖Fig.8 Chromatograms at Mobile phase ratio is25∶75

圖9 流動(dòng)相比例為30∶70時(shí)的液相色譜圖Fig.9 Chromatograms at Mobile phase ratio is30∶70

3.3 化合物吸收光譜測(cè)定

二極管陣列（DAD）檢測(cè)器，由于具有測(cè)定化合物吸收光譜的功能，在液相色譜的檢測(cè)器中比紫外檢測(cè)器應(yīng)用更為廣泛。在化合物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間一致的情況下，如化合物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖不一致，則有可能不是同一種物質(zhì)，或至少該化合物峰不純，不能判定為同一種物質(zhì)。本研究中，待測(cè)溶液中與苯甲酸保留時(shí)間一致的化合物，其光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)苯甲酸完全一致，因此，可確定該待測(cè)溶液中含有苯甲酸。標(biāo)準(zhǔn)苯甲酸和待測(cè)物的光譜圖見圖10。

4 結(jié)論

苯甲酸作為一種天然有機(jī)酸化合物，在自然界植物成分中廣泛分布，是植物的活性成分之一。本文采用高效液相色譜法對(duì)涼粉草提取物進(jìn)行分離分析，通過與苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，首次證明在涼粉草中天然含有微量有機(jī)酸——苯甲酸，可為其他植物中天然有機(jī)酸化學(xué)成分的鑒定提供參考，對(duì)涼粉草食療機(jī)理深入研究和資源進(jìn)一步科學(xué)開發(fā)利用具有積極意義。

圖10 液相色譜二極管陣列（DAD）檢測(cè)器測(cè)定的光譜圖Fig.10 Spectrogram detected by DAD

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Natural Organic Acid from Mesona Chinensis Benth

LI Yong1，YU Wei1，MA Yan-juan1，ZHAO Yong-feng1，YANG Jian2，LIU Jun-yi1，ZHENG Ling1，*
（1.Guangxi entry-exit Inspection and Quarantine bureau，Nanning 530021，Guangxi，China；2.Guilin Suntaste Juice Co.，Ltd.，Guilin 541000，Guangxi，China）

Benzonic acid，anew natural component discovered from Mesona chinensis Benth，was extracted with basic aqueous solution and determined by high performance liquid chromatography for the first time.The target compound was proved to be natural benzonic acid under different condition of HPLC，such as the choice of chromatogram columns，the mobile phase proportion and the spectrogram.The reported approach will be supplied for determination of natural organic acid for other plants.

Mesona chinensis Benth；benzonic acid；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.009

2013-03-07

李湧（1980—），男（漢），工程師，學(xué)士，研究方向：儀器分析。

*通信作者