黃一鳳，王 甦

揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 揚州225000

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，它們可以不斷地自我更新，并在特定條件下在體內(nèi)外轉(zhuǎn)變?yōu)楦螛蛹毎?，在肝臟疾病的治療中越來越受重視。

1 分化為肝樣細胞的各種MSCs 的來源

Shu 等［1］從體外培養(yǎng)的小鼠骨髓中分離出MSCs和肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，這兩種細胞都有分化為肝細胞的能力，但只有MSCs 能分化為肝樣細胞。目前，MSCs 主要來源于骨髓，骨髓源性MSCs易被病毒污染，其細胞數(shù)量及細胞增殖分化能力隨著年齡增長而下降;與BM-MSCs 相比，UC-MSCs 增殖能力更強［2］，免疫原性更低，且分化出的肝樣細胞仍保持低免疫原性。UC-MSCs 干細胞來源廣泛，不會產(chǎn)生異體排斥，沒有道德倫理的限制，因而成為干細胞領(lǐng)域的研究熱點。脂肪MSCs 也可分化為肝樣細胞，其分泌的G-CSF、IL-6、HGF 等細胞因子在肝衰竭的治療中發(fā)揮了重要作用。另外，MSCs 可從軟骨、臍血、胎盤組織、皮膚和骨骼肌的結(jié)締組織中、臍靜脈內(nèi)皮下層、成人膝關(guān)節(jié)滑膜、成人腮腺中［3］等處分離而來。胚胎干細胞、肝來源的干細胞及骨髓來源的肝干細胞在一定條件下均可分化為肝樣細胞。

2 MSCs 在體外分化為肝樣細胞

MSCs 分化為肝樣細胞的分子機制非常復(fù)雜，單純適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基不能誘導(dǎo)分化出特定的細胞類型，還需與生長因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)(ECM)等細胞微環(huán)境共同培養(yǎng)。

2.1 細胞角蛋白(CK)、激素及細胞外基質(zhì)(ECM)

許多CK 對體外肝細胞的生長和分化有影響，包括肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M(OSM)、表皮細胞生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、b 成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)等。另外，化合物如地塞米松(Dex)、維甲酸、丁酸鈉、尼克酰胺(NTA)、NA 和二甲亞砜等在肝細胞分化上也起作用。HGF 和成纖維細胞生長因子(FGF)在胚胎發(fā)育過程中的胚層起作用。OSM 在調(diào)節(jié)細胞生長和分化方面起著重要作用。Dong 等［4］通過實驗證實FGF-4、HGF 及OSM 在BMMSCs 分化為肝樣細胞中起著重要作用，且三者在BMMSCs 肝分化過程中起著不同作用:BM-MSCs 肝分化的早期階段由FGF-4 及HGF 協(xié)同作用，后期肝分化過程中OSM 起著至關(guān)重要作用。LIF 及IGF-1 均促進了BM-MSCs 向肝細胞分化;化合物如胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、NTA 和地塞米松都有相關(guān)報道表明它們對肝細胞分化起作用。Chivu 等［5］通過單獨或組合的方式比較了各種肝臟特定因子(HGF、ITS、Dex和NTA)的分化效率，發(fā)現(xiàn)HGF 和NTA 有較大的肝源潛能。ECM 能為細胞提供很好的附著層，為細胞生長、分化提供很好的微環(huán)境，有助于肝細胞形態(tài)和功能的成熟。

2.2 共培養(yǎng) 肝細胞、非實質(zhì)肝細胞及一些細胞因子在肝源分化中有重要作用。在體外將MSCs 與肝細胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)MSCs 分化為肝樣細胞。Zhang 等［6］將GFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs 與鼠肝細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)的MSCs 不僅呈典型的肝細胞形態(tài)，還大量表達肝細胞特異性標(biāo)記ALB、AFP 和CK-18。與HGF 共培養(yǎng)的MSCs 相比，前者在誘導(dǎo)肝細胞分化上效率更高。將鼠MSCs 與胎肝細胞共培養(yǎng)，這樣一個共培養(yǎng)體系不僅為鼠MSCs 分化為肝樣細胞提供了有力的環(huán)境，而且促進了胎肝細胞的分化和增殖。非實質(zhì)肝細胞與MSCs共培養(yǎng)有相似的影響。Yamazaki 等［7］將小鼠GFP 轉(zhuǎn)基因MSCs 與非實質(zhì)肝細胞和肝衰竭患者血清共培養(yǎng)，他們發(fā)現(xiàn)鼠MSCs 能轉(zhuǎn)分化為肝細胞。BM-MSCs與不同活化階段的HSC 共培養(yǎng)，只有完全活化且不是靜止的HSC 可以調(diào)節(jié)MSCs 分化為肝樣細胞。此外，肝臟本身可以被認為是MSCs 分化為肝細胞的理想場所，但是，這個機制還未完全闡明。

2.3 三維培養(yǎng) 許多研究顯示不同的細胞類型，包括肝臟起源或非肝臟起源的間質(zhì)細胞與肝細胞的3-D 共培養(yǎng)提高了體外肝細胞的活力和功能。3-D 模式可以提高膜極性和保持細胞結(jié)構(gòu)，維持功能特性和抑制標(biāo)記物的去分化。有關(guān)MSCs 分化為肝樣細胞的3-D 培養(yǎng)的相關(guān)研究很少。Piryaei 等［8］通過實驗證明有納米纖維培養(yǎng)環(huán)境促進了MSCs 向肝細胞分化，并可以在長時間內(nèi)使細胞保持其功能，這可能與納米纖維增強了能誘導(dǎo)分化的生長因子和細胞因子生物活性有關(guān)。Lin 等［9］使用三維藻酸鹽體系培養(yǎng)BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)這個三維體系能更好的誘導(dǎo)BM-MSCs 分化為肝樣細胞。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子 雖然肝源性分化的確切機制還未完全闡明，一些轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)用于誘導(dǎo)MSCs 轉(zhuǎn)分化為肝樣細胞。研究稱HNF3β 是老鼠胚胎形成時期肝臟生長的一個關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，同時對肝臟形成起著重要作用。Ishii 等［10］發(fā)現(xiàn)HNF3β 能有效地誘導(dǎo)UE7T-13 人BM-MSCs 分化。HNF-4α 過表達也可以促進BM-MSCs 向肝樣細胞的分化。

3 MSCs 在體內(nèi)分化為肝細胞

MSCs 在體外能誘導(dǎo)分化為肝樣細胞研究得到證實，但是MSCs 在體內(nèi)的分化特性還需進一步研究。

Petersen 等［11］及Arikura 等［12］的 實 驗 均 證 明MSCs 能在小鼠體內(nèi)分化為肝前體細胞甚至成熟的肝樣細胞。Hwang 等［13］將BM-MSCs 植入肝硬化大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 歸巢至肝實質(zhì)后，先分化為肝卵圓細胞，隨后分化為肝細胞樣細胞，并證實BM-MSCs 分化來的肝前體細胞減輕肝纖維化。

4 MSCs 分化的肝樣細胞的特性

MSCs 分化的肝樣細胞的特性包括形態(tài)學(xué)的、表型的和功能性的特點。形態(tài)上，我們可以看到從成纖維細胞樣到上皮細胞典型多邊形的變化;表型上，我們可以發(fā)現(xiàn)體外分化的臍帶MSCs 可貯存糖原，產(chǎn)生尿素氮，誘導(dǎo)細胞色素P450(CYP)3A4 活性等幾種肝細胞標(biāo)記，但也缺乏一些肝細胞標(biāo)記(HepPar1 或HNF-4α)。在MSCs 分化為肝細胞早期，這些細胞表達RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如巢蛋白(干細胞特有標(biāo)記物)、CX43(肝干細胞特有的縫隙連接蛋白)、CK19(上皮細胞標(biāo)記)和一些早期肝細胞分化標(biāo)記物(如AFP、CK7、HNF3β、GATA4、HNF4、HNF1α 和C/EBPα)［14］。相比之下，在MSC 分化的后期，它們表達的細胞標(biāo)記物和蛋白與成熟肝細胞表達的相似，如CK18、FoxM1、E-鈣黏著蛋白和連接蛋白32(CX32);分泌血漿蛋白如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和細胞間黏附分子;分化良好的肝細胞產(chǎn)生典型的酶，包括藥物代謝酶細胞色素P450 亞型3A4 和1A1、糖異生途徑磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1、參與尿素合成的酶氨甲酰磷酸合成酶(CPS)、胞膜蛋白水解酶二肽基肽酶Ⅳ型(CD26)［15］。人肝樣細胞也表達人肝細胞明確的標(biāo)記物Heppar1。同時，分化的肝細胞漸漸失去間充質(zhì)細胞表達的標(biāo)記物如α-SMA。

體內(nèi)肝細胞分化系統(tǒng)與體外肝細胞分化系統(tǒng)相比，體內(nèi)表型特征更復(fù)雜。肝臟損傷類型的不同，干細胞就會顯示不同的表型。在一個膽管梗阻引起的膽源性肝硬化模型中，灌注的細胞呈現(xiàn)一個活化的成纖維細胞樣或肌成纖維細胞樣表型，表達成纖維細胞特定蛋白和α-SMA。然而，用酒精處理引起的肝硬化，灌注的骨髓細胞呈現(xiàn)一個活化的肝血管內(nèi)皮細胞樣表型［16］。

5 MSCs 分化為肝樣細胞的機制

MSCs 轉(zhuǎn)分化為肝樣細胞的詳細機制仍然不清楚。橫向分化可能是其中的一個機制。在MSCs 分化為肝樣細胞中發(fā)生了間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化(MET)，MET 是上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的相反過程，EMT 是腫瘤進展和胚胎形成的關(guān)鍵步驟。Ochiya 等［17］發(fā)現(xiàn)EMT 調(diào)節(jié)子Twist 和Snail 表達水平在分化過程中表達下調(diào);同時，上皮標(biāo)記物如E-粘黏蛋白和α-連環(huán)蛋白在AT-MSCHepa 過程中表達上調(diào);相反，間質(zhì)標(biāo)記物如N-粘黏蛋白和波形蛋白表達下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示MET 出現(xiàn)在AT-MSCs 分化為肝細胞的過程中［18］。

Wnt 信號通路及Notch/Jagged 信號通路參與了MSCs 向肝樣細胞分化過程，阻滯Wnt 信號通路促進了分化過程。表觀遺傳修飾如DNA 甲基化和組蛋白乙酰化同樣也對MSCs 分化起作用。研究表明DNMTis 功能是作為肝細胞分化前預(yù)處理代理，而HDACis 是作為在分化中或分化后的興奮劑［19］。Snykers等［20］發(fā)現(xiàn)在經(jīng)肝源性刺激物預(yù)處理的人MSCs 加入曲古抑菌素A 培養(yǎng)6 d 后轉(zhuǎn)化成與原始肝細胞有相似表型和功能特性的細胞。植入MSCs 與宿主細胞融合也有可能是MSC 分化為肝樣細胞的一個機制，但細胞融合機制促使MSCs 分化的依據(jù)不足。

6 MSCs 分化的肝樣細胞的臨床應(yīng)用

陳楠等［21］發(fā)現(xiàn)MSCs 對實驗性自身免疫性肝炎小鼠具有治療作用，可以在短時間內(nèi)降低小鼠血清ALT 水平，緩解肝臟炎性細胞的浸潤。研究顯示，骨髓源性肝細胞的形成和長期定植在急、慢性肝臟損傷均可發(fā)生，但是慢性肝損傷更利于這一現(xiàn)象的持續(xù)存在。Terai 等［22］采用自體骨髓MSCs 移植治療肝硬化患者，移植后患者肝功能和MELD 評分顯著提高，提示肝纖維化或肝硬化所致的慢性嚴重肝損傷也可采取MSCs移植方法達到治療目的。Peng 等［23］對乙肝肝衰竭患者進行自體BM-MSCs 移植，移植組2 ～3 周內(nèi)MELD評分、TBIL、PT 及ALB 得到明顯改善，隨訪至192 周，患者肝癌患病率或死亡率與內(nèi)科治療相比無明顯差異，可見自體BM-MSCs 移植對治療乙肝肝衰竭患者短期療效較好，但長期療效有待進一步觀察。此外，目前已見應(yīng)用MSCs 成功治療遺傳代謝性肝病，包括Crigler-Najjar 綜合征［24］，但目前僅限于動物模型研究階段，尚無MSCs 應(yīng)用于臨床的文獻。鄧長卿等［25］已進行了UMSCs 治療肝衰竭、肝硬化和自身免疫性肝病的臨床研究，初步取得較滿意的臨床療效。但是UMSCs移植后短期療效顯著，長期療效稍差，需要反復(fù)移植。

7 安全性

體細胞起源的MSCs 通常被認為有優(yōu)越性，分化的MSCs 比未分化的MSCs 似乎更穩(wěn)定和安全，因為它們的譜系是轉(zhuǎn)化為肝細胞。未分化的MSCs 有仿制腫瘤細胞并自我更新的能力。Serakinci 等［26］將端粒酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入MSC 中，觀察到MSC 顯示了很高的腫瘤特異性。Rubio 等［27］的實驗結(jié)果顯示，體外實驗中MSCs 在6 ～8 周內(nèi)可以安全有效表達，但是從長期來看有可能會發(fā)生自發(fā)性的突變(4 ～5 個月)。

純化的T 細胞對同種異體MSCs 不會產(chǎn)生免疫應(yīng)答。但最近一項動物研究表明同種異體和異種的MSCs 注入免疫功能正常的主體后能引起記憶性T 細胞反應(yīng)。同種異體MSCs 容易被CD8+T 細胞和NK 細胞溶解，會引起淋巴細胞浸潤和炎癥，且易于發(fā)生NK細胞介導(dǎo)的細胞溶解。脂肪組織起源的干細胞分化成軟骨細胞后展現(xiàn)出免疫原性(上調(diào)HLA-DR)和免疫抑制(表達抑制免疫的HLA-G 和IL-10)［28］。

MSCs 在肝臟再生醫(yī)學(xué)中充當(dāng)著關(guān)鍵性的角色。除了肝細胞替代功能，MSCs 免疫調(diào)節(jié)和抗纖維化特性，不僅提高了MSCs 移植存活率和MSCs 的壽命，而且有助于一些免疫介導(dǎo)的肝臟疾病的治療，例如自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎。MSCs 分化為肝細胞的有效性和穩(wěn)定性需要得到改善，同時需要進行大量臨床試驗驗證MSCs 在人肝臟疾病中治療效果。

［1］ Shu SN，Wei L，Wang JH，et al. Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells［J］. World J Gastroenterol，2004，10(19):2818-2822.

［2］ Chen MY，Lie PC，Li ZL，et al. Endothelial differentiation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］. Exp Hematol，2009，37(5):629-640.

［3］ Rotter N，Oder J，Schlenke P，et al. Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands ［J］. Stem Cells Dev，2008，17(3):509-518.

［4］ Dong XJ，Zhang H，Pan RL，et al. Identification of cytokines involved in hepatic differentiation of mBM-MSCs under liver-injury conditions ［J］.World J Gastroenterol，2010，16(26):3267-3278.

［5］ Chivu M，Dima SO，Stancu CI，et al. In vitro hepatic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under differential exposure to liver-specific factors［J］. Transl Res，2009，154(3):122-132.

［6］ Zhang QH，Chen XG，Gui GH，et al. Spheroid formation and differentiation into hepatocyte-like cells of rat mesenchymal stem cell induced by co-culture with liver cells［J］. DNA Cell Biol，2007，26(7):497-503.

［7］ Yamazaki S，Miki K，Hasegawa K，et al. Sera from liver failure patients and a demethylating agent stimulate transdifferentiation of murine bone marrow cells into hepatocytes in coculture with nonparenchymal liver cells［J］. J Hepatol，2003，39(1):17-23.

［8］ Piryaei A，Valojerdi MR，Shahsavani M，et al. Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells on nanofibers and their transplantation into a carbon tetrachloride-induced liver fibrosis model［J］. Stem Cell Rev，2011，7(1):103-118.

［9］ Lin N，Lin J，Bo L，et al. Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells in an alginate scaffold［J］.Cell Prolif，2010，43(5):427-434.

［10］ Ishii K，Yoshida Y，Akechi Y，et al. Hepatic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by tetracycline-regulated hepatocyte nuclear factor 3beta ［J］. Hepatology，2008，48(2):597-606.

［11］ Petersen BE，Grossbard B，Hatch H，et al. Mouse A6-positive hepatic oval cells also express several hematopoietic stem cell markers［J］.Hepatology，2003，37(3):632-640.

［12］ Arikura J，Inagaki M，Huiling X，et al. Colonization of albumin-produsing hepatocytes derived from transplanted F344 rat bone marrow cells in the liver of congenic Nagase's analbuminemic rats［J］. J Hepatol，2004，41(2):215-221.

［13］ Hwang S，Hong HN，Kim HS，et al. Hepatogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a rat model of thioacetamide-induced liver cirrhosis［J］. Cell Biol Int，2012，36(3):279-288.

［14］ Pournasr B，Mohamadnejad M，Bagheri M，et al. In vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytelike cells［J］. Arch Iran Med，2011，14(4):244-249.

［15］ Sgodda M，Aurich H，Kleist S，et al. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from rat peritoneal adipose tissue in vitro and in vivo［J］. Exp Cell Res，2007，313(13):2875-2886.

［16］ Kienstra KA，Jackson KA，Hirschi KK. Injury mechanism dictates contribution of bone marrow-derived cells to murine hepatic vascular regeneration［J］. Pediatr Res，2008，63(2):131-136.

［17］ Ochiya T，Yamamoto Y，Banas A. Commitment of stem cells into functional hepatocytes［J］. Differentiation，2010，79(2):65-73.

［18］ Christ B，Dollinger MM. The generation of hepatocytes from mesenchymal stem cells and engraftment into the liver［J］. Curr Opin Organ Transplant，2011，16(1):69-75.

［19］ Milhem M，Mahmud N，Lavelle D，et al. Modification of hematopoietic stem cell fate by 5aza 2＇deoxycytidine and trichostatin A ［J］.Blood，2004，103(11):4102-4110.

［20］ Snykers S，Vanhaecke T，De Becker A，et al. Chromatin remodeling agent trichostatin A:a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow［J］. BMC Dev Biol，2007，7:24.

［21］ Chen N，Liu YL，Liu WT，et al. Mice autoimmune hepatitis treated by bone marrow mesenchymal stem cell［J］. Chin J Dig，2013，33(1):23-27.陳楠，劉應(yīng)莉，劉文天，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞治療小鼠自身免疫性肝炎［J］. 中華消化雜志，2013，33(1):23-27.

［22］ Terai S，Ishikawa T，Omori K，et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy［J］. Stem Cells，2006，24(10):2292-2298.

［23］ Peng LA，Zhu HP，Zheng YB，et al. Mesenchymal stem cells differentiate into hepatocyte-like cells under different induction systems in hepatitis B patients with liver failure［J］. Afr J Biotechnol，2011，10(5):840-847.

［24］ Khan AA，Parveen N，Mahaboob VS，et al. Treatment of Crigler-Najjar syndrome type 1 by hepatic progenitor cell transplantation:a simple procedure for management of hyperbilirubinemia［J］. Transplant Proc，2008，40(4):1148-1150.

［25］ Deng CQ. Umbilical cord mesenchymal stem cells biological characteristics and function research［D］. Suzhou University，2011.鄧長卿. 臍帶間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性及功能研究［D］. 蘇州大學(xué)，2011.

［26］ Serakinci N，Guldberg P，Burns JS，et al. Adult human mesenchymal stem cell as target for neoplastic transformation［J］. Oncogene，2004，23(29):5095-5098.

［27］ Rubio D，Garcia-Castro J，Martín MC，et al. Spontaneous human adult stem cell transformation［J］. Cancer Res，2005，65(8):3035-3039.

［28］ Technau A，F(xiàn)roelich K，Hagen R，et al. Adipose tissue-derived stem cells show both immunogenic and immunosuppressive properties after chondrogenic differentiation ［J］. Cytotherapy，2011，13 (3):310-317.