葛一漫 張朝明 胡一梅 王 毅 吳心語 謝國麗 張靈玲

(成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610072)

急性濕疹，又稱特應(yīng)性皮炎，是一種復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，主要表現(xiàn)為廣泛的、多形性對稱性紅斑丘疹、皮膚瘙癢、干燥、炎癥等，影響著全世界15%～30%的兒童和2%～10%的成年人［1］。濕疹是由多種內(nèi)、外因素引起的皮膚病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為與變態(tài)反應(yīng)有較密切的關(guān)系。治療濕疹這類變態(tài)反應(yīng)包括了局部類固醇和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。此類藥物如糖皮質(zhì)激素雖有較好的免疫抑制作用，但會出現(xiàn)皮膚萎縮、色素沉著等不良反應(yīng)，還可能出現(xiàn)代謝紊亂、誘發(fā)加重感染，不宜長期使用［2，3］。馬齒莧含有大量的多糖、揮發(fā)油、氨基酸等有效成份，具有止癢收澀功能，對濕疹的療效顯著［4］。

本實驗擬通過運(yùn)用馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠模型的進(jìn)行干預(yù)治療，觀察大鼠皮膚的腫脹度，結(jié)合局部皮損處TNF-α、IL-4 的表達(dá)，從促炎因子和抗炎因子平衡的角度，探討馬齒莧提取液對濕疹的抑制作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠，SPF 級，雌雄不限，體重180～220 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實驗動物合格證號:SCXK(111)2008-24。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 馬齒莧提取液 500 g 新鮮馬齒莧放于榨汁機(jī)內(nèi)榨取新鮮馬齒莧粗汁200 ml，用無菌紗布5 層過濾，獲得淺紅色馬齒莧提取液，盛放于消毒處理的玻璃瓶內(nèi)，置于低溫0～5℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 陽性藥 復(fù)方黃柏液，山東漢方制藥有限公司，生產(chǎn)批號:Z10950097。

1.2.3 2，4-二硝基氯苯(DNCB) 成都科龍化工試劑廠，批號:20090813。

1.3 實驗分組及造模 SD 大鼠40 只，隨機(jī)分為4個組，每組10 只，分別作為正常組、模型組、復(fù)方黃柏組、馬齒莧組。用電推剪及電剃須刀去除大鼠腹部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，并涂5%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)30 μl 于皮膚首次致敏，第3 天，在右背部剃毛區(qū)涂0.2%DNCB 50 μl 進(jìn)行二次抗原攻擊，左背部對稱的剃毛區(qū)不用藥物作為對照部位。以后每隔3 d 激發(fā)1 次，連續(xù)3 次。于第9 天觀察大鼠右背部較左背部明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、糜爛或滲出，表明造模成功。于第10 天開始，模型組、復(fù)方黃柏組、馬齒莧組分別給予1 ml 無菌蒸餾水、復(fù)方黃柏液和馬齒莧提取液，每天2 次，上下午各1次，連續(xù)9 d。所有實驗均根據(jù)赫爾辛基宣言和保護(hù)及運(yùn)用動物的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.4 實驗取材 造模后第21 天，斷頸處死動物，使用無菌手術(shù)剪將大鼠后背部右側(cè)造模區(qū)皮膚兩塊及對稱的左側(cè)健康皮膚一塊分別剪下，第一塊造模區(qū)皮膚與左側(cè)健康皮膚均采用直徑6 mm 圓形打孔器分別打下相同面積的皮膚，用分析天平(BS-600L，規(guī)格:600 g/0.1 g，上海友聲衡器有限公司)稱重(計量單位mg，精確到0.1 mg)。第二塊造模區(qū)皮膚，裝于DEPC 水處理過的EP 管中，放置10%中性甲醛溶液中固定48 h，待做免疫組化檢查。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 皮膚腫脹度指標(biāo) 皮膚腫脹度=炎癥皮膚重量-健康皮膚重量，抑制率%=(炎癥皮膚重量-健康皮膚重量)/健康皮膚重量×100%。

1.5.2 免疫組化檢測TNF-α、IL-4 含量 取上述經(jīng)過固定的皮膚組織，取材、逐級酒精脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片2 張，厚度4 μm，采用免疫組化SP 法分別做TNF-α、IL-4 染色，操作按照說明書進(jìn)行，設(shè)置陽性及陰性對照。TNF-α 一抗(克隆號:BA0131，兔抗鼠TNF-α 多克隆抗體)，IL-4 一抗(克隆號:BA0980，兔抗鼠IL-4 多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，相應(yīng)二抗及試劑盒購自北京中杉生物有限公司)。陽性物質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn):陽性物質(zhì)呈棕黃色、黃色、淺黃色，顆粒狀、細(xì)絲狀，位于細(xì)胞漿內(nèi)或間質(zhì)內(nèi)。顯微鏡下觀察TNF-α、IL-4 免疫組化染色切片，首先在低倍(×100)下觀察陽性物質(zhì)分布、范圍及位置，選擇陽性物質(zhì)最明顯處(“熱點(diǎn)”)5 個視野，然后在中倍(×200)下，采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量檢測上述5 個視野陽性物質(zhì)的積分光密度(IOD)，計算5 個視野陽性物質(zhì)的積分光密度總和，表示TNF-α、IL-4 含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢測數(shù)據(jù)用均±s 表示。采用t 檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮膚肉眼觀察結(jié)果 模型組大鼠在二次抗原攻擊后的9 d 內(nèi)，右背部較左背部皮膚出現(xiàn)明顯紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出(圖1A)。復(fù)方黃柏組、馬齒莧組隨著給藥時間的持續(xù)，大鼠右背部皮膚紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出癥狀得到明顯的改善(圖1B、C)。馬齒莧組比復(fù)方黃柏組癥狀改善更為明顯(圖1C)。

2.2 各組大鼠皮膚腫脹度以及抑制率結(jié)果 大鼠皮膚腫脹度及抑制率值，用藥組與模型組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，馬齒莧組與復(fù)方黃柏組相比也具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠皮膚組織TNF-α、IL-4 觀察檢測結(jié)果 顯微鏡下觀察TNF-α、IL-4 免疫組化染色切片(見圖2、3)，可見TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)呈顆粒狀、細(xì)絲狀，棕黃色、黃色、淺黃色，位于皮膚表皮棘細(xì)胞、皮膚附屬器汗腺細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、真皮內(nèi)炎細(xì)胞胞漿，部分位于真皮內(nèi)間質(zhì)組織中。

空白組大鼠背部皮膚內(nèi)TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色淺黃色，分布面積小、稀疏(A1、A2)。模型組大鼠背部皮膚組織內(nèi)TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色呈棕黃色、黃色，分布面積廣、密集(B1、B2)，復(fù)方黃柏組和馬齒莧組TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色呈黃色、淺黃色，分布面積縮小、較稀疏(C3、C4、D3、D4)。各組大鼠背部皮膚TNF-α、IL-4 半定量檢測結(jié)果，與模型組相比，復(fù)方黃柏組和馬齒莧組對濕疹大鼠皮膚組織有明顯的抑制作用(P＜0.01)。與復(fù)方黃柏組比較，馬齒莧組TNF-α、IL-4 含量也明顯降低也(P＜0.05)。見表2。

表1 馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠皮膚腫脹度的影響( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

表1 馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠皮膚腫脹度的影響( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，2)P＜0.01.

圖1 大鼠皮膚肉眼觀察結(jié)果Fig.1 Results of macroscopic observation of rat skin

圖2 皮膚組織中TNF-α 的表達(dá)(免疫組化染色，×200)Fig.2 Expression of TNF-α in skin tissue(immunohistochemical staining，×200)

圖3 皮膚組織中IL-4 的表達(dá)(免疫組化染色，×200)Fig.3 Expression of IL-4 in skin tissue (immunohistochemical staining，×200)

表2 馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠皮膚TNF-α、IL-4 的影響( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

表2 馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠皮膚TNF-α、IL-4 的影響( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with normal control group，1)P＜0.01;compared with model group，2)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，3)P＜0.05.

3 討論

急性濕疹是一種由多種內(nèi)外因素共同作用引起的復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚糜爛滲出、紅斑丘疹、水腫、瘙癢等。馬齒莧屬馬齒莧科，是我國古老的菜藥兼用植物，據(jù)《本草綱目》記載，臨床可用于“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”［5］?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明［6，7］，馬齒莧含有大量多糖、氨基酸、去甲腎上腺素等活性成分，具有消炎抑菌、增強(qiáng)免疫等作用。臨床上使用復(fù)方黃柏液治療嬰兒急性濕疹起到了較好作用，因此選擇該藥作為本實驗的陽性藥物［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠右背部皮膚較左背部明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出，腫脹度明顯增加，腫脹抑制率高達(dá)41.5%，這與Kim 等［9］報道的急性濕疹癥狀一致，表明本實驗造模成功。用藥后，復(fù)方黃柏組和馬齒莧組大鼠右背部皮膚急性濕疹癥狀得到明顯的改善，其中腫脹度與模型組比較明顯減輕，且馬齒莧組減輕更為顯著，這與胡一梅等［4］報道的鮮馬齒莧治療急性濕疹有明顯的療效是一致的，提示復(fù)方黃柏液和馬齒莧提取液均能改善濕疹癥狀，尤以馬齒莧提取液效果更為顯著。

急性濕疹屬于Ⅳ型超敏反應(yīng)性炎癥性疾病，是效應(yīng)T 細(xì)胞與特異性抗原結(jié)合后引起的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)過程中炎細(xì)胞會釋放炎癥介質(zhì)，包括促炎因子與抗炎因子。濕疹發(fā)生發(fā)展過程中，貫穿著這些炎癥介質(zhì)的相互作用，其變化對濕疹的發(fā)展方向與結(jié)局產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。既往對濕疹機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)［10，11］，免疫調(diào)節(jié)異常是濕疹發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其是Th 細(xì)胞亞群功能失衡，對于促炎因子和抗炎因子及其平衡與濕疹的關(guān)系少有報道。鑒于此，本實驗通過觀察大鼠濕疹皮膚促炎因子腫瘤壞死因子(TNF-α)和抗炎因子白細(xì)胞介素(IL-4)的改變，探討濕疹發(fā)生發(fā)展與促炎因子和抗炎因子的關(guān)系，為臨床治療濕疹提供另一種思路。

TNF-α 屬于促炎因子之一，TNF-α 含量增高不僅可促進(jìn)炎癥部位血管擴(kuò)張、血管壁通透性增加、趨化白細(xì)胞、發(fā)熱、致痛及引起炎癥部位組織損傷，導(dǎo)致炎癥程度加重，同時，還可引起IL-1、IFN 等促炎因子含量增加，進(jìn)一步加重濕疹皮損的炎癥反應(yīng)［12］。臨床上抗炎作用的途徑之一就是通過減少促炎因子包括TNF-α 的產(chǎn)生［13］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模成功后大鼠背部皮膚TNF-α 含量比空白組明顯增高，用藥后，復(fù)方黃柏組和馬齒莧組TNF-α 含量明顯低于模型組，同時馬齒莧組低于復(fù)方黃柏組。揭示馬齒莧提取液治療濕疹的可能機(jī)制之一是通過下調(diào)促炎因子TNF-α 的含量來發(fā)揮作用。

IL-4 屬于抗炎因子之一，炎癥過程中抗炎因子與促炎因子在不同的環(huán)節(jié)上相互作用、相互拮抗，發(fā)揮抑制炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)［14］，IL-4 不僅可調(diào)節(jié)T、B 淋巴細(xì)胞的分化、活化，促進(jìn)以Th2 細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答，同時還可通過抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 發(fā)揮抗炎作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組、復(fù)方黃柏組及馬齒莧組IL-4 含量顯著增高，并隨著TNF-α 含量的增高呈比例的增高，表明機(jī)體在炎癥時炎細(xì)胞生成釋放一定量促炎因子的同時也生成釋放相應(yīng)量的抗炎因子，限制炎癥的加重、放大，發(fā)揮炎癥的局部防御作用。然而，IL-4 具有抗炎作用的同時也具有促炎作用，它是B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE 所必需，在濕疹等變態(tài)反應(yīng)中IL-4 分泌過量導(dǎo)致IgE 的增高，IgE 的增高與濕疹發(fā)病顯著相關(guān)［15，16］，所以IL-4具有抗炎/促炎的雙重作用。這就意味著在臨床控制炎癥時，既要通過調(diào)控機(jī)體一定程度升高IL-4 的含量發(fā)揮其抗炎作用，又要適度控制升高幅度抑制其促炎作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比，模型組IL-4 顯著升高，并與TNF-α 呈比例增高，濕疹癥狀非常明顯，復(fù)方黃柏組、馬齒莧組大鼠皮膚組織的IL-4 含量輕微升高，但差異無顯著性。同時與模型組比，復(fù)方黃柏組、馬齒莧組大鼠皮膚組織的IL-4含量明顯降低，并與TNF-α 呈比例降低，濕疹癥狀顯著減輕，顯示模型組濕疹的形成不僅是由于TNFα 顯著增高所致，還可能是IL-4 呈比例過度增高引起，復(fù)方黃柏和馬齒莧提取液治療濕疹有明顯療效，其機(jī)制可能不僅是降低TNF-α 含量，同時還呈比例的降低IL-4 的含量，即馬齒莧提取液療效的另一個機(jī)制可能是適度地調(diào)控IL-4 的含量。

綜上所述，馬齒莧提取液對濕疹具有明顯的療效，其機(jī)制可能是通過下調(diào)TNF-α 的含量，同時適度地調(diào)控IL-4 的含量。

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