陳 俊 張 偉 翁秀芳 陸盛軍 吳雄文 梁智輝

(華中科技大學同濟醫(yī)學院免疫學系，武漢 430030)

移植物抗宿主病是骨髓移植后出現的多系統(tǒng)損害的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。臨床表現較為復雜，皮膚損害最早出現的癥狀有紅斑、丘疹、水皰，甚至皮膚剝脫，嚴重者皮損可在數天內擴展至全身。移植物抗宿主反應是一種特異的免疫現象，是由于移植物組織中的免疫活性細胞與免疫受抑制的、組織不相容性抗原受者的組織之間的反應。異種急性移植物抗宿主病模型是研究異種移植的有效途徑，該模型可在受者體內觀察供者免疫細胞對受者組織的攻擊，進一步明確移植物抗宿主排斥反應情況;該模型還可用于體內藥敏實驗研究，預測指導臨床治療方案的選擇和設計，以及探索放療、內分泌治療、免疫治療、基因治療及分子靶向治療等新型治療手段［1］。

目前對“人-鼠”模型的報道也較多，在選用動物的品系及種類等各方面都有不同的報道。本研究主要探討選擇合適小鼠品系，優(yōu)化相關實驗條件，建立穩(wěn)定的“人-鼠”異種移植物抗宿主病(X-GVHD)模型，為異種移植提供可靠的實驗模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 裸鼠:購自武漢大學動物實驗中心，BALB/c-nu，無菌級，雌性，4～5周齡，體重約12 g，質量合格證書編號00001655，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心。

非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷小鼠:購自北京華阜康生物科技股份有限公司，NOD/SCID，SPF級，雌性，5～6周齡，體重15 g，質量合格證書編號0180764，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心。

1.1.2 試劑 RPMI1640細胞培養(yǎng)液為Gibco公司產品;胎牛血清為杭州四季青公司產品;人CD3、CD4、CD8等抗體購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 X-GVHD模型小鼠的品系選擇 參照相關文獻，結合動物的易獲得性及飼養(yǎng)條件，本實驗選取裸鼠和NOD/SCID鼠建立“人-鼠”X-GVHD模型。兩種小鼠均接受全身γ射線照射(300 cGy)，之后隨機分組如表 1，參考相關文獻，選擇7×107～8×107細胞，以腹腔輸注途徑輸注人PBMC［2-7］。輸注后第10天，采用流式細胞術及免疫組化檢測各組小鼠體內各臟器中人淋巴細胞的浸潤情況。

1.2.2 人PBMC輸注途徑的選擇 常用的輸注途徑為腹腔和尾靜脈［5，8］，現設置實驗探討兩種輸注途徑對建立模型是否有影響。由1.2.1的結果可知，NOD/SCID小鼠較裸小鼠更易建立“人-鼠”X-GVHD模型，故選用NOD/SCID小鼠，按照前期處理方案處理之后，隨機分為對照組、腹腔輸注組、尾靜脈輸注組，腹腔輸注組通過腹腔輸注途徑輸注7×107～8×107人PBMC，尾靜脈輸注組通過尾靜脈途徑輸注7×107～8×107人 PBMC，對照組腹腔輸注等體積的PBS。

1.2.3 建立X-GVHD模型最適細胞量的確定 由

1.2.1 、1.2.2 可知，NOD/SCID 小鼠采用腹腔輸注途徑，可較好的建立“人-鼠”X-GVHD模型。現設置實驗，探索建立模型的最適細胞量。選取NOD/SCID小鼠，按照前期處理方案處理之后，隨機分為對照組、實驗組 1(2×107～3×107)、實驗組 2(4×107～5×107)、實驗組3(5×107～6×107)、實驗組4(7×107～8×107)。

1.2.4 觀察人T細胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間 第5天開始，模型鼠尾靜脈采血。加入推薦量的人CD3抗體后，于4℃避光孵育45 min，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌后上機檢測。

2 結果

2.1 NOD/SCID 鼠適合建立“人-鼠”X-GVHD 模型

第10天眼球取血處死小鼠，檢測模型鼠靜脈血及各臟器中人T細胞浸潤情況。NOD/SCID模型鼠外周血中人T細胞浸潤比例高達(69.53±8.49)%，而裸鼠實驗組僅為(5.6±1.81)%(圖 1)。H＆E 染色結果顯示，NOD/SCID實驗組較裸鼠實驗組浸潤情況嚴重。肺臟血管周圍聚集大量人的相關免疫細胞(圖2)，與流式結果吻合。其他臟器的情況與肺臟趨勢一樣，NOD/SCID實驗組較裸鼠實驗組浸潤情況嚴重。

2.2 腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無明顯差異

第10天時眼球取血檢測外周血中人T細胞所占比例，其中，腹腔輸注組人 T細胞所占比例為(69.53±8.49)%，尾靜脈輸注組人T細胞所占比例為(71.20±5.78)%，腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無統(tǒng)計學差異(圖3)。由于腹腔輸注途徑較尾靜脈輸注途徑方便，故采用腹腔輸注途徑。

2.3 每只輸注5×107以上的人PBMC能夠建立“人-鼠”X-GVHD模型 100%死亡率代表100%XGVHD模型成功率。如圖4所示，輸注2×107～3×107人PBMC，有50%無法完全構建成功;輸注4×107～5×107人PBMC，有25%無法完全構建成功;輸注5×107～6×107人PBMC，可以全部構建成功，平均生存時間為(14.5±2.2)d;輸注 7×107～8×107人PBMC，也可以全部構建成功，平均生存時間為(12±1.4)d。因此，可以得出結論:腹腔輸注 5×10以上的人PBMC可以穩(wěn)定建立X-GVHD模型。

表1 實驗小鼠分組Tab.1 Groups of mice

2.4 觀察人T細胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間為7～11 d 由圖5可知，第5天時人T細胞在小鼠外周血中浸潤比例較低，第11天時浸潤達到最高，之后進入平臺期。因此，我們認為7～11 d為觀察人T細胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間。

圖1 NOD/SCID鼠適合建立“人-鼠”X-GVHD模型Fig.1 NOD/SCID mice suitable for establishment of＂human-mouse＂ X-GVHD model

圖2 NOD/SCID實驗組模型小鼠肺臟組織血管周圍有較多的人淋巴細胞浸潤(H＆E，×400)Fig.2 More human lymphocyte infiltration lung tissue in NOD/SCID experimental group(H＆E，×400)

圖3 腹腔輸注途徑與尾靜脈輸注途徑無明顯差異Fig.3 No significant difference between intraperitoneal infusion and intravenous infusion

圖4 每只輸注5×107以上的人PBMC能夠建立“人-鼠”X-GVHD模型Fig.4 Each mice infusion of more than 5×107 human PBMC can establish ＂human-mouse＂ X-GVHD model

圖5 觀察人T細胞表型動態(tài)變化與功能的最佳時間為7～11 dFig.5 Best time to observe human T cell phenotype dynamics and function is 7 to 11 days

3 討論

GVHD發(fā)生需要的一些特定條件［9-12］:①宿主與移植物之間的組織相容性不合;②移植物中必需含有足夠數量的免疫細胞;③宿主處于免疫無能或免疫功能嚴重缺損狀態(tài)。

裸小鼠是由于染色體上等位基因(第11對染色體上)突變引起的，已經沒有正常的胸腺，原胸腺殘留結構部分上皮樣細胞呈巢狀排列而部分呈外分泌腺結構。由于無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常上皮，而這種上皮不能使T細胞正常分化，從而缺乏成熟T細胞的輔助、抑制及殺傷功能，因而細胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴細胞正常，但功能不全，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。

NOD/SCID正式名稱為 NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl，為SCID突變(Prkdcscid)基因被轉至 nonobese diabetic(NOD)的小鼠，Prkdcscid基因位于第十六對染色體上，轉譯為DNA-activated protein kinase(DNA-APK)催化的次單位，由于DNA-APK缺陷而影響淋巴干細胞分化為成熟的免疫細胞。NOD/SCID為近親品系，是非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交的［13］，而SCID的特征為喪失B與T淋巴細胞的功能［14］，NOD/Lt與SCID小鼠雜交得到NOD/SCID小鼠，除了喪失B與T淋巴細胞的功能特性外，還降低了 NK 細胞活性［15］，即 T、B、NK 三缺陷［16］。

由于裸鼠僅僅是T細胞缺陷，而B細胞、NK細胞以及其自身免疫相對較強，300 cGy的γ射線照射也不能使其長時間處在免疫無能或免疫功能嚴重缺損狀態(tài)，輸注的PBMC未能引發(fā)GVHD的發(fā)生也就不奇怪了。而NOD/SCID小鼠，由于T、B、NK三缺陷，再加上300 cGy的γ射線照射，免疫無能或免疫功能嚴重缺損狀態(tài)是完全可以達到的，只要輸注足夠數量的PBMC［2-7］，必定可以導致GVHD的發(fā)生。

文獻報道選擇裸鼠具有以下優(yōu)勢:①國內有相關文獻報道裸鼠可以建立“人-鼠”X-GVHD模型;②裸鼠較其他免疫缺陷鼠有價格優(yōu)勢，且易于購買;③飼養(yǎng)成本較低廉。但我們的實驗結果顯示，每只腹腔輸注8×10 以上的人PBMC，使用裸鼠建立“人-鼠”X-GVHD模型成功率較低，只有 23.5%，而NOD/SCID小鼠成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。經相關優(yōu)化手段優(yōu)化后，通過腹腔輸注5×107人PBMC，可以穩(wěn)定的建立“人-鼠”X-GVHD模型。結果還提示，輸注后第7～11天是尾靜脈動態(tài)觀察過繼的免疫細胞表型與功能的最佳時間窗口。

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