張 祥 喬 健 (復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200040)

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一種含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，它在體內(nèi)的蓄積，可造成高同型半胱氨酸血癥(Hyper-homocysteinemia，HHcy)。HHcy 是心腦血管疾病重要的危險(xiǎn)因素。然而，在多發(fā)性硬化(Mutiple Sclerosis，MS)等神經(jīng)變性疾病中也發(fā)現(xiàn)存在HHcy［1-3］，其病理機(jī)制和意義目前還不清楚。實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experiment autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS 較為理想的動(dòng)物模型［4］。本研究旨在通過(guò)對(duì)伴或不伴HHcy 的EAE 小鼠的觀察，探討HHcy 在MS 中出現(xiàn)的原因及可能的病理意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 普通育成料M02(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，MOG35-55 肽段(北京聯(lián)科生物公司)，結(jié)核菌素(Mycobacterium Tuberculosis H37Ra，TB，DIFCO Laboratory)，百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，List Biology Laboratory)，SBDF(同仁化學(xué)研究所)，蛋氨酸(Sigma-Aldreich 公司)，磷酸二氫鉀、甲醇、蘇木精-伊紅(HE)(國(guó)藥集團(tuán))，不完全弗氏佐劑(Sigma 公司)，IL-17、IFN-γ 和TNF-α 細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)試劑盒(eBioscience Company)。

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠和飲食 健康雌性8 周齡C57BL/6小鼠20 只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，清潔級(jí)飼養(yǎng)，自由飲食，自然作息。以普通育成料M02喂養(yǎng)，其中10 只在制模前48 小時(shí)開(kāi)始予飲水中添加4%蛋氨酸。

1.3 EAE 小鼠模型的建立及癥狀評(píng)估 稱取MOG35-55 肽段粉劑3 mg，溶于1 ml PBS 中;取5 mg TB，溶于1 ml 不完全弗氏佐劑;上述所制備的兩種液體以1 ∶1比例，采用針管混合器充分混合，制備成油包水樣乳白色混懸液。

分別取5 只有和沒(méi)有4% 蛋氨酸喂養(yǎng)的C57BL/6 小鼠，于背部脊髓二側(cè)四點(diǎn)皮下注射含MOG35-55 混懸液各50 μl，同時(shí)尾靜脈注射PTX 200 ng，48 h 后再次尾靜脈注射PTX 200 ng 加強(qiáng)免疫。每2 d 記錄小鼠體重，評(píng)估癥狀［0 分，無(wú)癥狀;1 分，垂尾;2 分，行路不穩(wěn)/后肢力弱/翻正反射遲鈍;3 分，后肢麻痹和(或)前肢力弱;4 分，前肢麻痹;5 分，死亡］。

1.4 小鼠血漿Hcy 的測(cè)定 Hcy 采用高效液相色譜-熒光法檢測(cè)［1］。應(yīng)用Waters 2690-2475 系統(tǒng)，衍生試劑為SBD-F，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀-甲醇，流速1 ml/min;色譜柱為ODS Hypersil 柱(250×4 mm，5 mm)，檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)385 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm。

1.5 EAE 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞提取 EAE 小鼠頸椎脫臼處死，于無(wú)菌條件下取脾臟，并剪碎、研磨，100 目濾網(wǎng)過(guò)濾后，4℃，2 000 r/min 離心10 min，取沉淀，加入無(wú)菌水2 ml，渦旋振蕩40 s 破除紅細(xì)胞，加入無(wú)菌2.7% NaCl 溶液1 ml，迅速振蕩混勻靜止，待自然沉淀后取細(xì)胞懸液，4℃，2 000 r/min 離心5 min，棄去上清，用4℃無(wú)菌1×PBS 溶液洗滌2次，再次離心，細(xì)胞重懸于DMEM 中備用。

1.6 EAE 單個(gè)核細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答觀察 將細(xì)胞以1×106ml 接種于24 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液中加入MOG35-55(10 μg/ml)，培養(yǎng)48 h，留取上清，按照ELISA 試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書對(duì)培養(yǎng)上清液中IL-17、IFN-γ、TNF-α 的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組數(shù)據(jù)用±s 表示。各組小鼠不同時(shí)間Hcy 平均濃度和體重變化的比較使用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，癥狀評(píng)分的比較采用非參數(shù)分析Mann-Whitney U 進(jìn)行統(tǒng)計(jì);各組小鼠細(xì)胞因子濃度比較使用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05 為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究將實(shí)驗(yàn)小鼠分為4 組，每組5 只:以普通育成料喂養(yǎng)的健康小鼠和EAE 小鼠(HC 組和EAE組)，添加蛋氨酸輔食的小鼠和EAE 小鼠(HC+Hcy組和EAE+Hcy 組)。

2.1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)Hcy 平均濃度的比較 如表1 所示，以普通育成料喂養(yǎng)的HC 和EAE 組小鼠的Hcy 平均濃度均分別顯著低于添加蛋氨酸輔食的HC+Hcy 和EAE+Hcy 組小鼠(P＜0.01)，提示添加蛋氨酸輔食可使C57BL/6 小鼠具有HHcy。EAE 制模被動(dòng)免疫后的1～3 周，EAE 成模組(EAE和EAE+Hcy 組)小鼠血清中Hcy 濃度，分別與同喂養(yǎng)模式下的對(duì)照小鼠(HC 和HC+Hcy 組)相比，均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表1，圖1)。提示小鼠在EAE 病理狀態(tài)下，并不會(huì)使體內(nèi)Hcy 水平有明顯增加。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)Hcy 平均濃度的比較(μmol/L)Tab.1 Mean levels of Hcy in mice from various groups at different time points (μmol/L)

圖1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)Hcy 平均濃度的比較Fig.1 Mean levels of Hcy in mice from various groups at different time points

表2 各EAE 成模小鼠不同時(shí)間點(diǎn)癥狀評(píng)分的比較Tab.2 Mean clinical scores of EAE mice from various groups at different time points

表3 各EAE 成模小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重(g)的比較Tab.3 Comparison of change of weight (g)of EAE mice from various groups at different time points

圖2 各EAE 成模小鼠不同時(shí)間點(diǎn)癥狀評(píng)分的比較Fig.2 Mean clinical scores of EAE mice from various groups at different time points

圖3 各EAE 成模小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重的比較Fig.3 Comparison of change of weights of EAE mice from various groups at different time points

2.2 各EAE 成模小鼠不同時(shí)間點(diǎn)癥狀評(píng)分和體重的比較 HC+Hcy 組小鼠在觀察期內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙及體重減輕，說(shuō)明單純添加蛋氨酸輔食并不會(huì)顯著干擾對(duì)小鼠癥狀的評(píng)估。各EAE 組小鼠于免疫后第9 天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，并在3 周內(nèi)癥狀逐漸加重。在免疫制模21 d，EAE+Hcy 組有1 只小鼠癥狀加重，發(fā)生死亡。自免疫制模后第15 天起始，各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)EAE+Hcy 組小鼠癥狀評(píng)分及體重的下降均顯著高于EAE 組對(duì)照小鼠(P ＜0.05)(表2 和3，圖2 和3)。

小鼠運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀評(píng)分及體重的變化，是評(píng)估EAE 嚴(yán)重程度重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示EAE+Hcy組小鼠癥狀顯著重于EAE 組，提示HHcy 可顯著加重EAE 臨床癥狀表現(xiàn)。

2.3 各EAE 成模小鼠致炎因子水平的比較 于免疫后21 天，取各組EAE 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，以MOG35-55 肽段刺激誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)，所測(cè)細(xì)胞因子水平顯示，EAE+Hcy 組小鼠TNF-α和IFN-γ 水平顯著高于EAE 組(P＜0.05)，而IL-17 水平在兩組中無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，圖4)。

3 討論

MS 是反復(fù)發(fā)作的，以腦、脊髓及視神經(jīng)等多處受累為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病。盡管MS被認(rèn)為是免疫相關(guān)性疾病，但有部分患者卻存在一些生化指標(biāo)的異常波動(dòng)，如尿酸、Hcy 等［1-3］，而這些指標(biāo)的異常是否由MS 病理過(guò)程所致，是否會(huì)影響疾病的發(fā)展等，還缺少相關(guān)的研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EAE 組小鼠血漿中Hcy 水平并未顯著高于健康對(duì)照小鼠。有文獻(xiàn)報(bào)道，MS 的發(fā)病可能與某些病原體感染有關(guān)，如肝炎病毒、EB病毒等［5］。病原體感染激發(fā)機(jī)體免疫防御機(jī)制，由于病毒等病原體和中樞組織發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，從而使得機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，造成MS 相關(guān)性的中樞織損傷［6］。由于EAE 模型由MOG35-55 肽段直接誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫所成，提示EAE 自身病理過(guò)程可能并不是產(chǎn)生HHcy 的原因。由此是否可推斷MS患者伴有HHcy 可能源于病原體對(duì)疾病的誘導(dǎo)階段，而不是產(chǎn)生于MS 患者體內(nèi)免疫應(yīng)答啟動(dòng)后的階段。這一假設(shè)有待于進(jìn)一步的研究證明。

圖4 不同EAE 組小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-17 因子水平的比較Fig.4 Comparison of levels of TNF-α，IFN-γ，IL-17 of EAE mice from various groups

EAE 具有類似MS 的臨床和病理表現(xiàn)，是被廣泛用于研究MS 的動(dòng)物模型。可用以制作EAE 模型的動(dòng)物有數(shù)種，包括C57BL/6 小鼠，而這種小鼠同時(shí)也可被用以制作HHcy。我們未查閱到以HHcy小鼠制作EAE 動(dòng)物模型的報(bào)道。通過(guò)在飲水中添加4%蛋氨酸，C57BL/6 小鼠體內(nèi)Hcy 水平在一周左右上升至同齡鼠的2～3 倍。以MOG35-55 肽段主動(dòng)免疫，小鼠于免疫后9 d 左右出現(xiàn)垂尾、行路不穩(wěn)等EAE 成模癥狀，表明采用以MOG35-55 肽段主動(dòng)免疫和飲水中添加4%蛋氨酸的方式，可以制作具有HHcy 的EAE 小鼠模型。

同國(guó)外報(bào)道相一致［7，8］，我們預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)C57BL/6 小鼠在開(kāi)始給予蛋氨酸輔食的10 天左右的時(shí)間內(nèi)，其體重增長(zhǎng)幅度較正常小鼠慢，但小鼠的日常活動(dòng)未出現(xiàn)變化，而一般在2 周左右的時(shí)間，小鼠體重開(kāi)始較穩(wěn)定的增長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未列于本文)。本實(shí)驗(yàn)顯示，HC+Hcy 組、EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠在2 周內(nèi)體重增長(zhǎng)幅度未有顯著差異，而在免疫15 d 后，HC+Hcy 組小鼠體重繼續(xù)保持增長(zhǎng)，EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠體重則出現(xiàn)明顯下降，而后者下降的幅度更為顯著。結(jié)合EAE+Hcy 組小鼠癥狀評(píng)分更重于EAE 組這一結(jié)果，說(shuō)明HHcy 可促進(jìn)EAE 的發(fā)展。以往較多研究表明，Hcy 可損傷血腦屏障中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)還可以通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能影響，使其釋放因子，激活或是募集炎性細(xì)胞到達(dá)局部，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)血腦屏障的損傷，從而使更多致炎細(xì)胞進(jìn)入中樞［9，10］。因此，HHcy 促進(jìn)EAE 的發(fā)展可能同其對(duì)血腦屏障破壞有關(guān)，然而，Hcy 是否可直接影響免疫細(xì)胞的功能呢?

目前認(rèn)為MS/EAE 是主要有T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性疾病，輔助性T 細(xì)胞中的TH1 和TH17 是主要的致病細(xì)胞，前者主要分泌IFN-γ、TNF-α 等，后者則主要分泌IL-17 等［11］。通過(guò)對(duì)EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子水平的比較，我們發(fā)現(xiàn)Hcy 可以促進(jìn)EAE 小鼠TNF-α 和IFN-γ 的產(chǎn)生，而對(duì)IL-17 無(wú)顯著影響。因此，Hcy可能主要通過(guò)促進(jìn)TH1 細(xì)胞相關(guān)致炎因子，而不是TH17 細(xì)胞相關(guān)致炎因子，而增強(qiáng)T 細(xì)胞的致病作用，使MS/EAE 的臨床癥狀加重。此結(jié)果也佐證了近年來(lái)有關(guān)Hcy 可影響機(jī)體免疫的報(bào)道。有研究表明，Hcy 除可以促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖［12］，還可通過(guò)T淋巴細(xì)胞等表面的NMDA 受體，使鈣離子流入細(xì)胞增多，促進(jìn)胞內(nèi)ROS 聚集，激活蛋白C、一氧化氮合成酶以及NADPH 氧化酶等，使IFN-γ 等炎性因子產(chǎn)生增多等［13-15］。

總之，通過(guò)對(duì)伴或不伴有HHcy 的EAE 小鼠模型的觀察，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)EAE 疾病過(guò)程中Hcy 水平的明顯升高，但HHcy 可以加重EAE 的臨床癥狀，其機(jī)理可能同Hcy 破壞血腦屏障，促進(jìn)TH1 細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ 等致炎因子有關(guān)。目前，Hcy 對(duì)機(jī)體免疫影響的研究還較為局限，隨著對(duì)此問(wèn)題的深入研究，將有助于進(jìn)一步闡明MS 患者中存在HHcy的原因及其意義。

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