李朝旭 王銳英 唐際存 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨二科，桂林 541004)

免疫治療是惡性腫瘤的有效治療方法之一，其中過繼免疫細(xì)胞治療是目前研究的熱點(diǎn)。γδT 細(xì)胞與αβ T 細(xì)胞不同，對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別、殺傷顯現(xiàn)出MHC 非限制性，因此γδT 細(xì)胞作為種子細(xì)胞的過繼免疫治療越來越受到人們的關(guān)注［1］。盡管越來越多的研究表明γδT 細(xì)胞對(duì)多數(shù)腫瘤具有殺傷作用，但是由于腫瘤存在多種的抑制性因素，影響了γδT細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用，因此，如何提高γδT 細(xì)胞腫瘤免疫治療效果成為目前急需解決的問題［2］。

我們先前研究顯示，Ⅱ型干擾素-γ(Interferon，IFN-γ)通過Fas/FasL 途徑增強(qiáng)人來源的γδT 細(xì)胞對(duì)骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)的殺傷作用［3，4］。但是作為目前已廣泛臨床應(yīng)用的Ⅰ型IFN，能否增強(qiáng)人γδT 細(xì)胞識(shí)別和殺傷OS 的作用未見報(bào)道。本研究觀察Ⅰ型IFN 體外刺激人γδT 細(xì)胞的抗OS 細(xì)胞的效應(yīng)，擬為OS 患者的免疫輔助治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞系HOS 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。唑來膦酸(Zoledronate，Zol)為瑞士諾華制藥公司產(chǎn)品，人重組白介素2(Interleukin-2，IL-2)，Ⅰ型IFN:IFN-α、IFN-β 購自上海普欣生物有限公司。淋巴細(xì)胞分離液購自加拿大Cedarlane 公司，CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品，人IFN-γ ELISA 試劑盒購自美國eBioscience 公司。鼠抗人TCR-γδ-PE 抗體、CD3-FITC抗體為美國eBioscience 公司產(chǎn)品。CytomicsTMFC500 型流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter 公司。胎牛血清、RPMI1640 干粉為Gbico 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 γδT 細(xì)胞制備和鑒定 取人靜脈抗凝血5 ml，磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)1∶1稀釋，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取24 孔培養(yǎng)板，每孔加入1 ml 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液為含100 ml/L 的胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為1 ×106～2 ×106ml;培養(yǎng)第1 天加入Zol 1 μmol/L 和人rIL-2 400 U/ml;以后每3 d 更換一半含人rIL-2 400 U/ml 或Ⅰ型IFN:IFN-α 和IFN-β 400 U/ml 的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d 收獲γδT 細(xì)胞，加入抗人TCR-γδ-PE mAb 2 μl 和抗人CD3-FITC mAb 1 μl 后4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)γδT 細(xì)胞的純度，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。公式:擴(kuò)增倍數(shù)=(擴(kuò)增后總細(xì)胞數(shù)×擴(kuò)增后γδT 細(xì)胞的純度)/(擴(kuò)增前總細(xì)胞數(shù)×擴(kuò)增前γδT 細(xì)胞的純度)［5］。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 以人骨肉瘤細(xì)胞系HOS 為靶細(xì)胞，設(shè)置不同效靶細(xì)胞比，根據(jù)乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)的操作說明，檢測(cè)并計(jì)算γδT 細(xì)胞的細(xì)胞毒性［5］。

1.2.3 γδT 細(xì)胞分泌的IFN-γ 水平的檢測(cè) 按照以前我們研究方案［6］，根據(jù)人IFN-γ ELISA 試劑盒的操作說明，檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IFN-γ濃度。

2 結(jié)果

2.1 γδT 細(xì)胞的體外擴(kuò)增 4 例健康人志愿者和10 例骨肉瘤患者(其中4 例原發(fā)性骨肉瘤，3 例復(fù)發(fā)性骨肉瘤和3 例轉(zhuǎn)移性骨肉瘤)參與本研究、其中健康人志愿者和骨肉瘤患者γδT 細(xì)胞的純度在擴(kuò)增前依次分別為(2.4±1.7)%和(2.2±0.9)%，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;經(jīng)過Zol 體外刺激誘導(dǎo)2 周后，γδT 細(xì)胞的純度達(dá)到(93.2±2.0)%，其中健康人志愿者γδT 細(xì)胞的純度為(94.6±1.6)%，骨肉瘤患者為(91.8±0.6)%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;擴(kuò)增倍數(shù)為(290.4±73.1)倍，其中健康人志愿者γδT 細(xì)胞的擴(kuò)增(398.4±73.1)倍，骨肉瘤患者為(162.4±83.2)倍，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

2.2 Ⅰ型IFN 對(duì)γδT 細(xì)胞的增殖影響 分別使用IFN-α、IFN-β 聯(lián)合Zol 體外刺激誘導(dǎo)14 d 后，γδT細(xì)胞 的 純 度 分 別 為(91.9±1.0)% 和(90.9±1.3)%，其中健康人志愿者γδT 細(xì)胞的純度分別為(93.6±1.2)%和(94.1±2.1)%，骨肉瘤患者分別為(90.2±0.8)%和(88.9±1.7)%，與Zol 組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05);擴(kuò)增倍數(shù)分別為(272.4±83.2)倍和(262.4±77.6)倍，其中健康人志愿者γδT 細(xì)胞的擴(kuò)增分別達(dá)到(432.4±80.2)倍和(392.4±97.3)倍，骨肉瘤患者為分別達(dá)到(172.4±83.2)倍和(162.4±70.1)倍，骨肉瘤患者與健康人的γδT 細(xì)胞的擴(kuò)增有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01);但與Zol 組相比，IFN-α 組和IFN-β 組骨肉瘤患者γδT 細(xì)胞的擴(kuò)增無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

2.3 Ⅰ型IFN 對(duì)健康人γδT 細(xì)胞殺傷活性的影響 圖1 為健康人γδT 細(xì)胞在1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1的效靶比下，對(duì)HOS 細(xì)胞的殺傷作用。在較低效靶比情況下，健康人γδT 細(xì)胞對(duì)HOS 細(xì)胞的殺傷作用較弱，但是分別使用IFN-α、IFN-β 預(yù)處理γδT 細(xì)胞72 h 后，健康人γδT 細(xì)胞對(duì)HOS 細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

2.4 Ⅰ型IFN 對(duì)骨肉瘤患者γδT 細(xì)胞殺傷活性的影響 圖2 顯示，不同類型骨肉瘤患者PBMCs 來源的γδT 細(xì)胞在效靶比為3∶1時(shí)，對(duì)HOS 細(xì)胞殺傷率較弱。分別使用IFN-α、IFN-β 預(yù)處理γδT 細(xì)胞72 h后，骨肉瘤患者PBMCs 來源的γδT 細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞殺傷活性顯著增加(P ＜0.05)。

2.5 Ⅰ型IFN 對(duì)γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ 的影響 在效靶比為3∶1時(shí)，與HOS 細(xì)胞共培養(yǎng)6、24 和48 h，健康人PBMCs 來源的γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ 較少，分別使用IFN-α、IFN-β 預(yù)處理γδT 細(xì)胞72 h 后，HOS細(xì)胞刺激γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ 顯著增加(圖3，P ＜0.05)。

圖1 Ⅰ型IFN 對(duì)健康人γδT 細(xì)胞殺傷骨肉瘤細(xì)胞的影響Fig.1 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from healthy donors

圖2 Ⅰ型IFN 對(duì)骨肉瘤患者γδT 細(xì)胞殺傷骨肉瘤細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from osteosarcoma patients

圖3 Ⅰ型IFN 對(duì)γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ 的影響Fig.3 Effect of type Ⅰ IFN on IFN-γ released by γδT cells

3 討論

目前有關(guān)γδT 細(xì)胞免疫治療骨肉瘤的研究逐漸受到關(guān)注。我們研究表明Zol 體外刺激骨肉瘤患者、健康人PBMC，能高度選擇性擴(kuò)增γδT 細(xì)胞［5］。另外，這種方法擴(kuò)增的γδT 細(xì)胞在體內(nèi)外均具有抗OS 作用［6］。但是由于腫瘤存在多種的抑制性因素，如腫瘤細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子、腫瘤微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞等，影響了γδT 細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用。為提高γδT 細(xì)胞的殺傷作用，我們分別使用IFN-γ、Zol預(yù)處理骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IFN-γ、Zol 能促進(jìn)γδT 細(xì)胞對(duì)骨肉瘤的殺傷作用［3，4，7］。但是，體內(nèi)使用IFNγ、Zol 具有較大的毒副作用以及臨床效果的不確定性，限制了進(jìn)一步臨床應(yīng)用。因此，如何減少藥物毒副作用、提高體外培養(yǎng)的γδT 細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用成為目前研究的熱點(diǎn)［1］。

IFN 分IFNⅠ、IFNⅡ和IFN Ⅲ三型，其中IFNⅠ型主要包括IFN-α 和IFN-β。研究顯示，Ⅰ型IFN可通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒的復(fù)制;同時(shí)還可增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性，促進(jìn)B 細(xì)胞的增生，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。IFN-α 也能上調(diào)細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的達(dá)，增強(qiáng)CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)。由于具有強(qiáng)大的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，Ⅰ型IFN 已廣泛應(yīng)用于臨床。本研究使用IFN-α 和IFN-β，觀察其對(duì)γδT 細(xì)胞的體外擴(kuò)增和殺傷作用的影響。研究顯示，Ⅰ型IFN 對(duì)γδT 細(xì)胞的體外增殖盡管沒有影響，但是分別使用IFN-α、IFNβ 預(yù)處理γδT 細(xì)胞后，健康人γδT 細(xì)胞對(duì)HOS 細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng);尤其重要的是，這種作用同樣適用于不同類型骨肉瘤患者的γδT 細(xì)胞，為骨肉瘤患者應(yīng)用自體γδT 細(xì)胞免疫治療提供了技術(shù)支持。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，分別使用IFN-α、IFN-β 預(yù)處理γδT 細(xì)胞72 h 后，γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ 能力顯著增加，結(jié)果與Watanabe 等［8］研究結(jié)果一致。

本研究不足之處是:盡管本研究中Ⅰ型IFN 能增強(qiáng)γδT 細(xì)胞的體外抗OS 作用，但是其在體內(nèi)試驗(yàn)中的作用如何，還需進(jìn)一步研究確定。此外，Ⅰ型IFN 能促進(jìn)γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ，但其具體機(jī)制目前尚不清楚，因此，Ⅰ型IFN 促進(jìn)γδT 細(xì)胞分泌IFN-γ機(jī)制的闡明，將為Ⅰ型IFN 聯(lián)合γδT 細(xì)胞治療骨肉瘤帶來新的機(jī)遇。

綜上所述，使用Ⅰ型IFN 體外擴(kuò)增γδT 細(xì)胞，不僅能增強(qiáng)γδT 細(xì)胞具有抗OS 作用，還克服了Ⅰ型IFN 的毒副作用，為骨肉瘤的治療提供了新的途徑。

［1］Li Z.Potential of human gammadelta T cells for immunotherapy of osteosarcoma［J］.Mol Biol Rep，2013，40(1):427-437.

［2］Lopez RD.Inhibiting inhibitory pathways in human γδT cells［J］.Blood，2013，122(6):857-858.

［3］Li Z，Xu Q，Peng H，et al.IFN-gamma enhances HOS and U2OS cell lines susceptibility to gammadelta T cell-mediated killing through the Fas/Fas ligand pathway［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(4):496-503.

［4］李朝旭，唐際存，葉招明.IFN-γ 增強(qiáng)人γδT 細(xì)胞殺傷骨肉瘤細(xì)胞的研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33 (1):22-25.

［5］李朝旭，孫凌凌，程瑞林，等.唑來膦酸刺激健康人和骨肉瘤PBMCs 體外擴(kuò)增γδT 細(xì)胞的研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(8):822-824.

［6］李朝旭，唐際存，孫凌凌，等.唑來膦酸對(duì)骨肉瘤患者PBMCs來源γδT 細(xì)胞抗骨肉瘤作用的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29(1):6-9.

［7］Li Z，Peng H，Xu Q，et al.Sensitization of human osteosarcoma cells to Vgamma9Vdelta2 T-cell-mediated cytotoxicity by zoledronate［J］.J Orthop Res，2012，30(5):824-830.

［8］Watanabe N，Narita M，Yokoyama A，et al.Type I IFN-mediated enhancement of anti-leukemic cytotoxicity of gammadelta T cells expanded from peripheral blood cells by stimulation with zoledronate［J］.Cytotherapy，2006，8(2):118-129.