徐加兵 于生蘭 歐陽(yáng)臻 洪偉鳴 (江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013)

黃芪(Radix Astragali)是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是中醫(yī)補(bǔ)氣的要藥。由于其多種有益機(jī)體的功效，現(xiàn)已有不少黃芪制成的藥品及功能食品投放市場(chǎng)。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，簡(jiǎn)稱AST)是中藥黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，為黃芪及其制劑質(zhì)量鑒定的重要指標(biāo)［1］。目前常用的黃芪甲苷檢測(cè)方法或者操作步驟較為復(fù)雜，靈敏度低，或者分析成本高，耗時(shí)長(zhǎng)［2］。免疫檢測(cè)作為一種篩選檢測(cè)技術(shù)，具有高靈敏度和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，而獲得特異性強(qiáng)、靈敏度高的抗體是建立一種準(zhǔn)確可行的免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵。AST 分子量小，是典型的半抗原，需結(jié)合一個(gè)合適的載體蛋白分子后才具有免疫原性［1］。相關(guān)文獻(xiàn)表明不同的載體蛋白對(duì)人工抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體的靈敏度和特異性有較大影響。因此要獲得特異性強(qiáng)，靈敏度高的抗體，選擇一種合適的蛋白作為合成人工抗原的載體是一項(xiàng)必不可少的研究。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和匙孔型血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)是兩種常用的蛋白載體［3］。本研究利用BSA 和KLH 兩種載體蛋白合成黃芪甲苷人工抗原，通過(guò)比較免疫小鼠抗血清的特異性，對(duì)兩種不同載體免疫原的免疫原性進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 AST 標(biāo)準(zhǔn)品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗式完全佐劑(FCA)、弗式不完全佐劑(FICA)，Sigma 公司;羊抗鼠酶標(biāo)抗體、TMB 單組份顯色劑，美國(guó)Pierce 公司;甲醇、NaIO4均為分析純。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、自動(dòng)洗板，美國(guó)布魯克·道爾頓有限公司;MALDITOF/TOF 質(zhì)譜儀(Applied Biosystem，4800 普通型)。

1.2 動(dòng)物 BALB/c 小鼠，雌性，6 只，SPF 級(jí)，6 周齡，體重16～18 g，揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 人工抗原的合成 溶液配制:將AST 溶于80%甲醇中配成濃度約為3 mg/ml 的溶液取1.7 ml。稱取2.6 mg NaIO4溶于0.5 ml 蒸餾水中。AST氧化:用0.1 ml 注射器將AST 溶液緩緩滴加至NaIO4溶液中，室溫反應(yīng)4 h。除去多余高碘酸鈉:慢慢往上述反應(yīng)液中滴加乙二醇4 ml 室溫反應(yīng)2 h，以終止反應(yīng)除去過(guò)量的NaIO4防止蛋白載體變性。與蛋白偶聯(lián):稱取5 mg BSA 溶于1 ml 碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)中，將經(jīng)NaIO4氧化后的AST 溶液緩緩滴加到BSA 溶液中。封閉避光反應(yīng)6 h，移至透析袋中，先用PBS 透析，再逐漸降低PBS 濃度至最后以蒸餾水透析，透析72 h。AST-KLH、ASTOVA 的合成方法同上［4］。

1.4 人工抗原的鑒定

1.4.1 紫外全波長(zhǎng)掃描法鑒定AST-BSA、ASTKLH、AST-OVA 將半抗原AST、載體蛋白(BSA、KLH、OVA)以及人工抗原，配制成一定濃度的溶液，在200～400 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描，比較人工抗原紫外吸收曲線與游離半抗原、載體蛋白差異［2，4］。

1.4.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜法鑒定AST-BSA 偶聯(lián)比 經(jīng)ZipTip C4 脫鹽處理后取1 μl 蛋白樣品點(diǎn)至樣品靶位上，自然干燥后，再取0.6 μl SA 基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)的靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。在正離子模式下選擇線性方法對(duì)樣品測(cè)試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試然后對(duì)樣品AST-BSA的分子量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)分子量測(cè)定結(jié)果，計(jì)算偶聯(lián)比。偶聯(lián)比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST。

1.4.3 紫外吸收法測(cè)定AST-KLH 的偶聯(lián)比 由于KLH 的相對(duì)分子量較大，不能通過(guò)時(shí)間飛行質(zhì)譜檢測(cè)AST-KLH 的偶聯(lián)比，故采用在紫外吸收法測(cè)定AST-KLH 的偶聯(lián)比，方法如下:先用甲醇精確配制不同濃度的AST 和KLH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將AST-KLH 稀釋到適當(dāng)濃度后用紫外分光光度計(jì)測(cè)出AST、ASTKLH 在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，在此基礎(chǔ)上分別測(cè)定偶聯(lián)物中AST 和載體蛋白的偶聯(lián)比，采用Lowry法計(jì)算出偶聯(lián)物中蛋白質(zhì)含量。半抗原與蛋白質(zhì)結(jié)合比的計(jì)算公式為:偶聯(lián)比=(AST 質(zhì)量濃度/AST 相對(duì)分子質(zhì)量)/(載體蛋白的質(zhì)量濃度/載體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量)［5］。

1.5 動(dòng)物免疫及抗體血清檢測(cè) 選擇15 只小鼠，隨機(jī)分成三組，每組5 只，標(biāo)記為組一、組二、組三。組一5 只小鼠以AST-KLH 免疫，組二中5 只小鼠以AST-BSA 免疫，組三中5 只小鼠以生理鹽水混合佐劑注射作為空白對(duì)照。免疫方法如下:首次免疫，取一定蛋白濃度的免疫抗原(AST-BSA、AST-KLH)加入等體積弗氏完全佐劑，乳化完全，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。每只小鼠每次注射100 μl，含100 μg的免疫原(按蛋白含量計(jì)算)。2 周后，第一次加強(qiáng)免疫(方法同首免);2 周后，第二次加強(qiáng)免疫(將首免的弗氏完全佐劑換為弗氏不完全佐劑，其余同首免);1 周后眶窩靜脈叢采血，將所采得的血液于37℃水浴放置2 h 后，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液備用［6］。分別用AST-OVA、ASTKLH 作包被抗原，間接酶聯(lián)免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA)檢測(cè)ASTBSA 免疫小鼠抗血清抗體效價(jià)，AST-KLH 免疫鼠抗血清分別采用AST-OVA 和AST-BSA 作包被抗原檢測(cè)。采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)對(duì)多抗血清與AST 進(jìn)行抑制試驗(yàn)［7］，在進(jìn)行icELISA 時(shí)同樣使用除免疫抗原外的兩種不同人工抗原包被。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷人工抗原的鑒定 黃芪甲苷、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收曲線見(jiàn)圖1。AST、BSA 出峰值的對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)分別為200 nm 和230 nm 左右。AST-BSA 峰左移，對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)在210 nm 左右，證明偶聯(lián)成功。同樣KLH 出峰值的波長(zhǎng)為280 nm 左右。AST-KLH 峰左移，對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為215 nm 左右，證明偶聯(lián)成功。

圖1 抗原紫外全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Identification of antigen by ultraviolet wavelength scanning

圖2 AST-BSA 飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定圖Fig.2 Identification of AST-BSA and BSA by MALDI TOF MS

2.2 偶聯(lián)比的確定 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品及AST-BSA 偶聯(lián)物的飛行時(shí)間質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。按照公式:偶聯(lián)比=(MAST-BSA-MBSA)/MAST，計(jì)算的偶聯(lián)物AST-BSA 的偶聯(lián)比為13∶1。分別測(cè)定AST 和AST-KLH 的吸光度，其中AST 的A210=0.8，KLH 的A280=1.2，ASTKLH 的A280=1.5，按文獻(xiàn)［5］的計(jì)算公式ASTKLH 的偶聯(lián)率為15，符合文獻(xiàn)［8］推薦的理想范圍8～25.1內(nèi)。

2.3 抗體滴度測(cè)定 測(cè)定之前采用棋盤方陣法測(cè)定最佳抗原包被濃度約為4 μg/ml，分別以ASTKLH、AST-OVA 包被酶標(biāo)板，采用倍比稀釋法檢測(cè)AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清效價(jià)，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，兩種人工抗原免疫小鼠所得的血清抗體效價(jià)均在1∶512 00 以上，AST-BSA 免疫的小鼠血清抗體效價(jià)略高，表明本實(shí)驗(yàn)所制備的兩種人工抗原均能刺激小鼠產(chǎn)生抗體。

2.4 抗體特異性鑒定 以4 μg/ml AST-OVA 作為包被抗原包被酶標(biāo)板，以AST 為競(jìng)爭(zhēng)抑制劑進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果圖4 所示。從圖中可知，AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清特異性較差;AST-KLH 免疫的小鼠的多抗血清特異性較強(qiáng)，IC50 最小劑量可達(dá)5μg/ml，可見(jiàn)AST-KLH免疫的小鼠的多抗血清具有很好的特異性。

圖3 兩種人工抗原免疫的小鼠血清效價(jià)檢測(cè)Fig.3 Titer of serum of mice immunized by two artificial antigens

圖4 抗體異性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection of specificity of antibodies

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以BSA、KLH 兩種不同蛋白為載體成功合成了黃芪甲苷(AST)的人工抗原，抗原偶聯(lián)比均在文獻(xiàn)推薦范圍內(nèi)，保證了合成抗原免疫原性強(qiáng)，能產(chǎn)生針對(duì)AST 的抗體［8］。用兩種人工抗原免疫小鼠，結(jié)果均獲得了效價(jià)較高的多抗血清。其中ASTKLH 免疫的小鼠血清效價(jià)較之AST-BSA 免疫的小鼠略低，分析原因可能是BSA 是哺乳動(dòng)物的血清白蛋白，而KLH 是無(wú)脊椎動(dòng)物的血藍(lán)蛋白，相比而言BSA 與哺乳動(dòng)物小鼠的親緣性要強(qiáng)，蛋白本身產(chǎn)生的免疫性要弱，故產(chǎn)生的抗體多是針對(duì)AST 的抗體;而KLH 與小鼠親緣性較弱蛋白本身的免疫原性要強(qiáng)，產(chǎn)生的抗體有一部分是針對(duì)KLH 的。但是用AST-KLH 免疫的小鼠產(chǎn)生的抗體的特異性較之AST-BSA 免疫小鼠所獲得的抗體血清要強(qiáng)，導(dǎo)致這種差異的可能原因如下:第一，理論上KLH 上有更多的抗原結(jié)合位點(diǎn)，AST-KLH 刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)，AST 的暴露面與機(jī)體接觸的幾率更大［9］。第二，AST-BSA 乳化注射小鼠會(huì)經(jīng)歷一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)外翻并再于體內(nèi)復(fù)性的過(guò)程，復(fù)性后的蛋白可能和天然蛋白的結(jié)構(gòu)不盡相同，而KLH 不存在這個(gè)過(guò)程，故產(chǎn)生的抗體具有更強(qiáng)的特異性［10，11］。本試驗(yàn)根據(jù)AST 有多個(gè)鄰羥基結(jié)構(gòu)存在的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選用高碘酸鈉法合成抗原，結(jié)果證明合成是成功的，方法是可行的。通過(guò)比較不同人工抗原免疫小鼠所產(chǎn)生的抗體性質(zhì)可以看出，KLH 作為蛋白載體合成的人工抗原所產(chǎn)生的抗體特異性更強(qiáng)并且抗體的特異性和人工抗原的蛋白載體有較大聯(lián)系。因此選擇一種合適的載體蛋白是制備人工抗原的先決步驟。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)成功制備了對(duì)AST 特異性較強(qiáng)的抗血清，為進(jìn)一步研究和建立黃芪甲苷的免疫學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

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