陸永江 劉 華

解放軍第四七四醫(yī)院骨科，新疆烏魯木齊830013

唑來膦酸對(duì)去勢大鼠骨折后骨痂和骨微結(jié)構(gòu)的影響

陸永江 劉 華▲

解放軍第四七四醫(yī)院骨科，新疆烏魯木齊830013

目的探討唑來膦酸對(duì)去勢大鼠骨折后骨痂和骨微結(jié)構(gòu)的影響。方法將45只SD雌性大鼠分為骨質(zhì)疏松組（30只）和正常對(duì)照組（15只），骨質(zhì)疏松組雌性大鼠被切除雙側(cè)卵巢制作骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，正常對(duì)照組大鼠僅給予假手術(shù)；骨質(zhì)疏松模型建模成功后，將骨質(zhì)疏松組30只大鼠再次隨機(jī)分為生理鹽水組（15只）和唑來膦酸組（15只）；對(duì)兩組大鼠制作股骨骨折模型，并分別給予生理鹽水和唑來膦酸進(jìn)行干預(yù)；在藥物干預(yù)4周后，比較生理鹽水組和唑來膦酸組骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨痂和骨微結(jié)構(gòu)情況。結(jié)果卵巢切除術(shù)后8周，正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松組大鼠股骨的骨密度分別為（0.197±0.028）g/cm2和（0.128±0.037）g/cm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在藥物干預(yù)4周后，兩組骨質(zhì)疏松大鼠股骨均有骨痂形成，而唑來膦酸組大鼠骨痂明顯大于生理鹽水組，且骨折線較為模糊；與生理鹽水組大鼠比較，唑來膦酸組大鼠骨小梁間隙較小，排列也較為整齊致密，更接近正常對(duì)照組大鼠。結(jié)論唑來膦酸可促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折后骨痂形成，并提高其骨密度。

唑來膦酸；骨質(zhì)疏松；股骨骨折；骨痂；骨微結(jié)構(gòu)

由于社會(huì)老齡化的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥的患病率明顯升高，一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，全世界年齡超過50歲的人群中，約有一半的人患有該病或伴有不同程度的骨量降低[1]。而骨質(zhì)疏松性骨折在臨床上也較為常見，其主要病理表現(xiàn)為骨量減少、骨顯微結(jié)構(gòu)異常、骨脆性增加。因此，臨床上有較多的患者在使用以雙膦酸鹽為代表的藥物預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥，它可有效降低骨質(zhì)疏松患者髖部及脊椎的病理性骨折的發(fā)生率，約有超過400萬大于45歲的美國婦女在使用此類藥物[2]。本研究通過切除雌性大鼠卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，以探討唑來膦酸對(duì)去勢大鼠骨折后骨痂和骨微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠45只，由蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動(dòng)物中心提供，體重250～300 g；實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（室溫保持于25～30℃，濕度保持在45%左右），飼養(yǎng)環(huán)境為完全清潔級(jí)，飼養(yǎng)顆粒和飲用水均經(jīng)過嚴(yán)格消毒；定時(shí)進(jìn)行通風(fēng)、消毒及照明，并于每日更換墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

克氏針（規(guī)格：1.2 mm，唐山先鋒醫(yī)療器械有限公司）；DR數(shù)字化攝影機(jī)（UD-150B-10型，日本東芝）；雙能X線吸收儀（法國Medi公司）；切片機(jī)、載玻片、石蠟、染色劑等病理組織標(biāo)本制作裝置（由解放軍474醫(yī)院病理科提供）；Olympus顯微鏡（AH-2型，日本奧林巴斯公司）；醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（MIAS型，中國北航公司）；唑來膦酸（艾瑞寧，規(guī)格：4 mg，國藥準(zhǔn)字H20041955，國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司）；水合氯醛（揚(yáng)州市奧鑫助劑廠）；生理鹽水，由解放軍第四十四醫(yī)院（以下簡稱“我院”）制劑室提供。

1.3 分組及骨質(zhì)疏松模型的建立

將上述45只雌性SD大鼠分為骨質(zhì)疏松組（30只）和正常對(duì)照組（15只）；按照3mL/kg的劑量使用水合氯醛對(duì)雌性SD大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，在無菌條件下進(jìn)行手術(shù)操作，正常對(duì)照組大鼠僅給予假手術(shù)，骨質(zhì)疏松組雌性大鼠被切除雙側(cè)卵巢；兩組大鼠接受手術(shù)后可自由活動(dòng)并進(jìn)食，連續(xù)3 d給予青霉素（80萬U，2次/d）預(yù)防感染；術(shù)后第8周，所有雌性SD大鼠行雙能X線吸收儀檢測，檢測后采用MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，對(duì)比正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松組大鼠骨密度；將骨質(zhì)疏松組30只大鼠再次隨機(jī)分為生理鹽水組（15只）和唑來膦酸組（15只）。

1.4 骨折模型的建立

在骨質(zhì)疏松模型建立成功1周后，以3 m L/kg的劑量使用水合氯醛對(duì)骨質(zhì)疏松組大鼠腹腔麻醉，選擇單側(cè)股骨進(jìn)行消毒，取大鼠股骨中段為手術(shù)切口，逐層分離股骨中段皮膚、皮下組織及深層筋膜，直至暴露出股骨骨膜并咬斷股骨，隨后用克氏針進(jìn)行髓內(nèi)固定，術(shù)畢逐層關(guān)閉手術(shù)切口，術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素（80萬U，2次/d）預(yù)防感染。

1.5 藥物干預(yù)

于骨質(zhì)模型成功建立后，生理鹽水組大鼠皮下注射生理鹽水，10 mL/kg，每周1次，連續(xù)4周；給予唑來膦酸組大鼠唑來膦酸，5 mg/kg，皮下注射，每周1次，連續(xù)4周。兩組大鼠可自由活動(dòng)并進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制于25～30℃，濕度保持在45%左右，每天定時(shí)照明、通風(fēng)及消毒。

1.6 骨痂的對(duì)比方法

在藥物干預(yù)4周后，使用水合氯醛對(duì)唑來膦酸和生理鹽水組骨質(zhì)疏松大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，并對(duì)大鼠斷肢股骨進(jìn)行X線片檢查，觀察并比較兩組大鼠骨折線處骨痂生長及骨折線模糊情況。

1.7 骨微結(jié)構(gòu)的對(duì)比方法

在藥物干預(yù)4周后處死所有45大鼠，手術(shù)切取患側(cè)股骨，剔除股骨周圍肌肉和軟組織，取出克氏針，切取股骨中段及骨痂組織，逐步對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定、脫鈣、包埋、切片及HE染色；由我院病理科醫(yī)師顯微鏡下觀察骨微結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組與骨質(zhì)疏松組大鼠骨密度比較

在造模過程中，正常對(duì)照組和唑來膦酸組各有1只大鼠死亡，其中正常對(duì)照組大鼠在麻醉過程中死亡，唑來膦酸組大鼠在制作骨折模型中出現(xiàn)死亡，其余大鼠均存活，未出現(xiàn)感染。于卵巢切除術(shù)后8周，采用雙能X線吸收儀，比較正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松組大鼠股骨的骨密度，分別為（0.197±0.028）g/cm2和（0.128± 0.037）g/cm2，骨質(zhì)疏松組大鼠骨密度明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），。

2.2 骨痂的X線比較

在藥物干預(yù)4周后，采用X線拍片的方法，比較唑來膦酸組和生理鹽水組骨質(zhì)疏松組大鼠股骨骨痂形成狀況。由圖1、2可以看出，兩組骨質(zhì)疏松大鼠均有骨痂形成，而唑來膦酸組大鼠骨痂明顯大于生理鹽水組，且骨折線較為模糊。

2.3 骨微結(jié)構(gòu)的比較

在藥物干預(yù)4周后，顯微鏡下比較各組大鼠股骨的骨微結(jié)構(gòu)，正常對(duì)照組大鼠骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則，粗細(xì)較為一致，排列緊密并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；而另兩組骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁骨小梁排列相對(duì)疏松，且體積小數(shù)目少，可見骨小梁斷裂缺損；與生理鹽水組大鼠比較，唑來膦酸組大鼠骨小梁間隙較小，排列也較為整齊致密，更接近正常對(duì)照組大鼠。見圖3～5。

3 討論

骨折的愈合過程往往牽涉一系列的生物因子，主要包括有細(xì)胞、細(xì)胞外組織及眾多細(xì)胞因子，該過程較為復(fù)雜。骨折愈合從組織學(xué)上可概括為血腫和炎癥期、初始骨痂反應(yīng)期、軟骨形成期和骨形成改建期等四個(gè)階段[3-4]。骨質(zhì)疏松性骨折是臨床診療過程中較為常見的一類疾病，好發(fā)于老年及女性，尤其是絕經(jīng)后女性，這主要與雌性激素活性水平降低，導(dǎo)致骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)異常及骨密度降低有關(guān)，有較高的發(fā)病率和致殘率。骨質(zhì)疏松性骨折與其他類型的暴力性骨折有一定區(qū)別，骨質(zhì)疏松患者的骨密度低于正常人，骨小梁明顯變薄、缺損，甚至穿孔導(dǎo)致骨的微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，骨骼內(nèi)髓腔面積進(jìn)一步增大，骨皮質(zhì)消耗變薄，因此骨質(zhì)疏松患者在在骨折發(fā)生率高的同時(shí)，其發(fā)病后往往較其他暴力性骨折難以恢復(fù)，臨床治療效果不明顯，病程較長[5-7]。使用何種辦法促使骨質(zhì)疏松性骨折骨痂盡快形成，骨微結(jié)構(gòu)盡快修復(fù)，從而促進(jìn)患者早日康復(fù)成為目前研究焦點(diǎn)之一。本組研究通過切除SD雌性大鼠卵巢制作骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，以探討唑來膦酸對(duì)去勢大鼠骨折后骨痂和骨微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步為唑來膦酸應(yīng)用于骨質(zhì)疏松性骨折提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

圖1 X線片示唑來膦酸組大鼠骨痂形成情況

圖2 X線片示生理鹽水組大鼠骨痂形成情況

圖3 正常對(duì)照組大鼠骨微結(jié)構(gòu)（HE染色，50×）

圖4 唑來膦酸組大鼠骨微結(jié)構(gòu)（HE染色，50×）

圖5 生理鹽水組大鼠骨微結(jié)構(gòu)（HE染色，50×）

唑來膦酸屬于最新一代雙膦酸鹽類藥物，具有類似于焦磷酸鹽的結(jié)構(gòu)，它的P-C-P結(jié)構(gòu)代替了后者的P-O-P基團(tuán)，具有有效P-C-P基團(tuán)的雙膦酸鹽類藥物可以抵制由破骨細(xì)胞產(chǎn)生的焦磷酸酯酶的水解作用，并在一定程度上保持體內(nèi)的穩(wěn)定性[8]。相關(guān)研究顯示，雙膦酸鹽類藥物可以有效抑制骨吸收并明顯增加骨量，是目前治療骨質(zhì)疏松較為重要的藥物之一，并被應(yīng)用于惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的治療當(dāng)中。雙膦酸鹽類藥物主要作用為抑制骨吸收，機(jī)制可能為：①直接改變破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，從而抑制其功能；②與骨基質(zhì)理化結(jié)合，直接干擾骨吸收；③直接抑制成骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子如IL-6、TNF的產(chǎn)生[9-12]。本組研究顯示，卵巢切除后的雌性大鼠經(jīng)一定時(shí)間喂養(yǎng)后，其骨密度明顯低于正常大鼠，說明雌性激素可導(dǎo)致骨量不同程度降低；進(jìn)一步通過股骨內(nèi)置入克氏針制作骨質(zhì)疏松模型，采用生理鹽水與唑來膦酸對(duì)比的治療方法，結(jié)果顯示唑來膦酸組大鼠骨痂明顯大于生理鹽水組，骨折部位愈合較快；通過顯微鏡下觀察，接受唑來膦酸干預(yù)的骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨微結(jié)構(gòu)更接近正常大鼠，說明唑來膦酸有助于骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的恢復(fù)。這可能與以下因素有關(guān)：①唑來膦酸能抑制骨吸收，還能增加骨密度，使喪失的骨組織恢復(fù)；②唑來膦酸能夠增加小梁骨的再建，也能減小骨吸收陷窩深度；③改變了骨基質(zhì)的活性，進(jìn)而影響了基質(zhì)對(duì)破骨細(xì)胞的激活；④影響成骨細(xì)胞系分化增殖，調(diào)節(jié)Ca2+細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化成熟[13-16]。

綜上所述，唑來膦酸可促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折后骨痂形成，并提高其骨密度，但該藥若廣泛應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松性骨折，尚需設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的大規(guī)模、多中心、隨機(jī)對(duì)照研究，為其進(jìn)一步提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

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Effects of Zoledronic Acid on callus and bone m icrostructure after fracture in osteoporosis rats

LU Yongjiang LIU Hua▲
Department of Orthopedics,the 474th Hospital of People's Liberation Army,Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830013,China

Ob jective To investigate the effects of Zoledronic Acid on callus and bone microstructure after fracture in osteoporosis rats.M ethods 45 SD female rats were divided into osteoporosis group(30 cases)and control group(15 cases),the female rats osteoporosis group were ovariectomized tomakemodel of osteoporosis,the rats of normal control were only given sham-operated;after themodel of osteoporosis wasmade successfully,the 30 rats of osteoporosis group were again random ly divided into saline group(15 cases)and Zoledronic Acid group(15 cases);all rats of osteoporosis group weremade femur fracturemodel,and been given saline and Zoledronic Acid to treatment;4 weeks after drug intervention,the callus and bonemicrostructure situation of rats were observed and compared.Results At 8 weeks after ovariectomy,the BMD of femur in SD rats of osteoporosis group and control group were(0.197±0.028)g/cm2and (0.128±0.037)g/cm2kespectively,the difference was significant(P＜0.05);after 4 weeks of drug intervention,all rats of two groups had osteoporosis femur bone callus formation,and callus in rats of Zoledronic Acid group was significantly greater than that of the saline group,and the fracture linewasmore blurred;compared with the rats of saline group, the trabecular bone gap in rats of Zoledronic Acid group wasmore smaller,compact and tidy arrangementwas relatively closer to the normal control group.Conclusion Zoledronic Acid can promote the rat osteoporotic bone fracture callus formation and increase bone density.

Zoledronic Acid;Osteoporosis;Femoral fractures;Callus;Bonemicrostructure

R285.5

A

1673-7210（2014）02（c）-0011-04

2013-10-18本文編輯：衛(wèi)軻）

▲通訊作者