陳文，馬茹，梁若男，李成龍，余軒，王浩

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

8-異前列腺素F2α檢測(cè)方法研究進(jìn)展

陳文，馬茹，梁若男，李成龍，余軒，王浩*

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

脂質(zhì)過氧化（Lipid peroxidation，簡(jiǎn)稱LPO）與很多衰老現(xiàn)象和疾病密切相關(guān)，對(duì)于脂質(zhì)過氧化機(jī)理以及對(duì)其具有抑制功能的抗氧化劑的研究已成為食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的熱點(diǎn)。8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandinF2α，簡(jiǎn)稱8-iso-PGF2α）是細(xì)胞膜上酯化的花生四烯酸被自由基催化后裂解所形成的前列腺素衍生物，是目前公認(rèn)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最有效生物標(biāo)記物，因此，建立準(zhǔn)確、可靠的8-iso-PGF2α的測(cè)定方法就顯得尤為重要。本文就脂質(zhì)過氧化、8-iso-PGF2α來源、標(biāo)記功能等進(jìn)行了概述，并對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)展進(jìn)行了重點(diǎn)闡述，以期為該領(lǐng)域的研究工作提供參考。

8-異前列腺素F2α；測(cè)定方法；脂質(zhì)過氧化；抗氧化劑

脂質(zhì)過氧化是指脂類的多不飽和脂肪酸在自由基的引發(fā)下經(jīng)酶促或非酶促作用，使其發(fā)生過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物的過程。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于脂質(zhì)過氧化、自由基損傷以及抗氧化劑的研究已成為食品、化妝品、生理學(xué)和流行病學(xué)等領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究結(jié)果表明，脂質(zhì)過氧化與很多衰老現(xiàn)象和疾病密切相關(guān)[1]。多不飽和脂肪酸在氧化過程中產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化物，引起機(jī)體代謝紊亂，并導(dǎo)致DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶和生物膜的損傷，進(jìn)而引發(fā)一系列疾病。據(jù)報(bào)道，目前危害人類健康的三大殺手——心血管、腦血管和癌癥，其發(fā)病機(jī)制均與自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有著直接的關(guān)系。而抗氧化劑可有效清除生物體內(nèi)的自由基，進(jìn)而起到保護(hù)人體細(xì)胞組織、心腦血管循環(huán)系統(tǒng)，抗癌及延緩衰老等生理作用。近年來，保健食品行業(yè)發(fā)展迅速，引起人們的廣泛重視。在食品中添加具有清除自由基作用的功效成分，可有效清除體內(nèi)的自由基，提高機(jī)體免疫力、抗衰老能力等，因此，脂質(zhì)過氧化機(jī)理的深入研究對(duì)于相關(guān)疾病的預(yù)防、診治以及篩選抗氧化保健食品功能材料，進(jìn)而開發(fā)出具備抗氧化功能保健食品來抑制脂質(zhì)過氧化的負(fù)面作用具有重要意義。

對(duì)于脂質(zhì)過氧化機(jī)理的深入研究，首先要明確其狀態(tài)的評(píng)價(jià)方法。目前評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的方法一般可分為：脂質(zhì)過氧化底物的測(cè)定和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物兩類，后者的應(yīng)用較為廣泛。脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一是丙二醛（MDA），在適當(dāng)?shù)臈l件下，它可與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成一種紅色物質(zhì)，反應(yīng)式見圖1，該物質(zhì)在532 nm處有一特征吸收[1]，據(jù)此可以測(cè)定MDA的含量，人們稱此法為TBA反應(yīng)物法。該法可用來指示脂質(zhì)過氧化的程度[2]。

圖1 硫代巴比妥酸法原理Fig.1 The principle of TBA method

硫代巴比妥酸法成本低廉、設(shè)備要求低，易于推廣應(yīng)用，因此，該法被廣泛用于測(cè)定氧化應(yīng)激的標(biāo)志物MDA的含量以評(píng)估脂質(zhì)過氧化的狀態(tài)[3-4]。但由于專一性不好、靈敏度差，且生物體系中基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾物多，使得該法的應(yīng)用受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[5]。Morrow等[6]報(bào)道了F2-異前列腺素（F2-isoprostanes）這一類化合物，它具有類似前列腺素F2α的復(fù)雜基團(tuán)。8-iso-PGF2α是F2-異前列腺素的主要成分。8-iso-PGF2α的化學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)生過程均不易受外界環(huán)境的影響，是目前最新公認(rèn)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最有效的生物指標(biāo)之一[7-9]。這為尋找簡(jiǎn)捷、價(jià)廉、專一性好、靈敏度高及易于普及應(yīng)用的方法進(jìn)行脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 8-iso-PGF2α概述

8-iso-PGF2α是自由基攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)花生四烯酸，使之發(fā)生過氧化反應(yīng)后所形成的特異性終產(chǎn)物，其形成機(jī)制見圖2。

圖2 F2-異前列腺素的形成機(jī)制Fig.2 Mechanism of formation of F2-isoprostanes

1990年，Morrow等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期冷凍的血漿中8-iso-PGF2α的含量明顯增加，同時(shí)他們還證實(shí)該過程是非酶催化的自由基攻擊花生四烯酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。這種化合物是前列腺素的異構(gòu)體，且均含有F型環(huán)戊烷，因此，被命名為F2-異前列腺素復(fù)合物（F2-ips）。根據(jù)F2-ips異構(gòu)位點(diǎn)的不同，可分為VI、IV、V和III型[10]。F2-ips通過還原反應(yīng)大部分生成F2-ip，同時(shí)還生成異血栓素、E2-ip、D2-ip、D2異縮酮、E2異縮酮等[11]。在體內(nèi)F2-ips通過還原反應(yīng)所形成的各種物質(zhì)中，F(xiàn)2-ip的含量最為豐富，它也可分為iPF2α-III、iPF2α-IV、iPF2α-V、iPF2α-VI 4個(gè)亞型[12]，其中iPF2α-III是最具代表性的F2-ip，也稱作8-iso-PGF2α或15-F2t-iP，其在F2-ip中所占的比例最大，存在于體液，如尿液、血液和腦脊液等以及肝、腦等組織中。

8-iso-PGF2α除具備諸如血管收縮劑、誘導(dǎo)內(nèi)皮素釋放和血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗凝結(jié)以及介導(dǎo)炎癥早期反應(yīng)等生物活性功能外[13-15]，其作為評(píng)估脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的功能更受到廣泛關(guān)注。8-iso-PGF2α是花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的特異性終產(chǎn)物，且生成途徑不依賴環(huán)氧化酶的催化，在機(jī)體組織上生成后釋放到血液中，最終通過尿液排出體外，從生成到排出的整個(gè)過程不易受到藥物或其他因素的影響[16]，因此，其在體液和機(jī)體組織中的含量非常穩(wěn)定，能特異、靈敏地反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的狀態(tài)，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化程度和損傷的最理想指標(biāo)。

2 8-iso-PGF2α測(cè)定方法

8-iso-PGF2α以及其他F2-ip作為評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的標(biāo)志物，無論是體液如血液、尿液和膽汁中[17-18]，還是大腦、肝臟和脈管系統(tǒng)[19-21]等組織中的8-iso-PGF2的含量均已通過各種方法進(jìn)行了測(cè)定。8-iso-PGF2α自發(fā)現(xiàn)以來，其測(cè)定方法主要有以下幾種：

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定法（GC-MS）

GC-MS法是測(cè)量8-iso-PGF2α最常用、最成熟的方法，該法具備較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，曾被認(rèn)為定量測(cè)定F2-ips的參考方法（金標(biāo)準(zhǔn)）。電噴霧離子化技術(shù)（ESI）與質(zhì)譜的結(jié)合大大提高了檢測(cè)方法的靈敏度，此外，GC-MS-MS方法的高靈敏度和特異性，完全可以通過僅提取少量機(jī)體的組織或體液來定量測(cè)定其中8-iso-PGF2α的含量，從而直接評(píng)估機(jī)體的脂質(zhì)過氧化情況。但該法對(duì)于樣品的凈化程度要求較高，一般需要通過固相萃取（solid phase extraction，簡(jiǎn)稱SPE）或薄層色譜（TLC）來進(jìn)行樣品的凈化。Liu Wei等通過C18SPE和SPE硅膠柱、薄層色譜技術(shù)來凈化樣品制備過程中的干擾基質(zhì)[22]。Mas等也利用C18SPE柱和氨基SPE柱來凈化尿液樣品[23]。Chu等則集樣品的凈化和提取于一步，僅使用十八烷基鍵合硅膠SPE柱來凈化血液樣品[24]，并利用配備DB-5MS毛細(xì)管柱的Agilent GC-MS在選擇離子模式下測(cè)定F2-異前列腺素的含量。因此，可以預(yù)見隨著SPE新型填料的不斷推出，SPE預(yù)處理樣品技術(shù)將變得更為簡(jiǎn)便和高效。但是，對(duì)于GC-MS法測(cè)定8-iso-PGF2α來說，除了繁瑣的樣品預(yù)處理步驟外，還需要衍生化步驟、較高的設(shè)備要求以及需要專業(yè)人員進(jìn)行操作都限制了該法推廣應(yīng)用。

最初，Morrow和Roberts應(yīng)用GC-MS法，采用商品化的同位素標(biāo)記的前列腺素F2α（PGF2α）做內(nèi)標(biāo)[25]測(cè)定了樣品中總F2-ips（酯化的和游離的）的含量。但由于前列腺素的同位素標(biāo)記物和其異構(gòu)體的理化性質(zhì)不完全相同，因此用同位素標(biāo)記前列腺素來測(cè)定F2-ips的含量是該法的一個(gè)缺陷。目前市場(chǎng)上已有同位素標(biāo)記8-iso-PGF2α的內(nèi)標(biāo)物出現(xiàn)，滿足了內(nèi)標(biāo)物的要求。Liu Wei等以8-iso-PGF2α-d4為同位素內(nèi)標(biāo)（Cayman Chemical，Cat.No.316351），以C18SPE和硅膠SPE柱、薄層色譜為樣品預(yù)處理技術(shù)，借助衍生化手段，應(yīng)用GC-MS法測(cè)定了機(jī)體組織、血液和尿液中F2-ips的含量[22]，其GC-MS配備15m DB1701硅膠毛細(xì)管柱?？紤]到尿液中內(nèi)源性的化合物可能是同位素標(biāo)記物8-iso-PGF2α-d4的共洗脫物，Mas等利用自己實(shí)驗(yàn)室合成的4（RS）-F4t-neuroprostane作為內(nèi)標(biāo)物，利用配備VF-1ms毛細(xì)管柱的GC-MS在NICI模式下測(cè)定了尿液中8-iso-PGF2α的含量[23]。該方法不但拓寬了GC-MS方法的應(yīng)用范圍，而且為復(fù)雜樣品基質(zhì)中8-iso-PGF2α含量的測(cè)定提供了思路借鑒。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定法（LC-MS/MS）

該法的特點(diǎn)是靈敏度較高，對(duì)樣品的凈化步驟要求不嚴(yán)，預(yù)處理簡(jiǎn)單、快捷，相對(duì)GC-MS法來說，又避免了繁瑣的衍生化步驟。此外，該法能夠同時(shí)測(cè)定多種異前列腺素，而免疫測(cè)定法每次只能測(cè)定一種。該方法也存在著靈敏度不如GC-MS的缺陷，但并不影響對(duì)于體液和組織中的8-iso-PGF2α含量的測(cè)定。

1996年，Murphy等報(bào)道首次使用該技術(shù)來測(cè)定異前列腺素的含量[26]，其主要儀器條件為：Ultracarb品牌的ODS 5μm，4.6 mm×25 cm分離柱，流動(dòng)相為pH5.7的氫氧化銨和乙腈：甲醇（95∶5，體積比），配備三重四級(jí)桿MS進(jìn)行目標(biāo)物離子的監(jiān)測(cè)。Taylor[27]等通過將SPE和液液萃取相結(jié)合，對(duì)傳統(tǒng)的液液萃取方法進(jìn)行了改進(jìn)，同時(shí)他們還縮短了液相的分離時(shí)間以得到較高的峰高，兩方面的改進(jìn)提高了該法的靈敏度，最終測(cè)定了血漿中總15-series F2-isoprostanes的含量。Sicilia[28]等充分發(fā)揮該法對(duì)樣品凈化要求不嚴(yán)的優(yōu)勢(shì)，利用該法測(cè)定了CCl4所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化小鼠肝臟、腎臟和尿液中8-iso-PGF2α含量，為復(fù)雜生物基質(zhì)樣品中8-iso-PGF2α含量的測(cè)定提供了方法借鑒。近年來該法的應(yīng)用次數(shù)呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[29-30]?？梢?，LCMS/MS是一種具備較好發(fā)展前景的檢測(cè)技術(shù)。

2.3 免疫親和色譜-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法（Immuno-GC-MS）

免疫親和色譜是利用抗體或者與抗體相關(guān)的材料作為固定相的色譜技術(shù)?？贵w對(duì)抗原性物質(zhì)的選擇性結(jié)合使該技術(shù)越來越多地應(yīng)用于生物物質(zhì)以及非生物物質(zhì)的分離、純化和分析。其與GC-MS結(jié)合來測(cè)定8-iso-PGF2α含量的方法稱為免疫親和色譜-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法。該法主要應(yīng)用免疫親和柱的凈化作用和質(zhì)譜的定量功能進(jìn)行測(cè)定，其優(yōu)點(diǎn)是免疫親和柱可以重復(fù)利用，并可以代替所有的凈化程序，但免疫親和柱的壽命有限，需要不斷地添加抗體。其一般測(cè)定程序是首先將待測(cè)樣品通過免疫親和色譜柱，其中待測(cè)目標(biāo)物以及類似物與柱中的抗體結(jié)合，不與抗體結(jié)合的其他樣品組分通過淋洗被除去。最后，將結(jié)合在固定相上的的待測(cè)目標(biāo)物洗脫下來進(jìn)GC-MS檢測(cè)。Bachi等應(yīng)用該方法測(cè)定了尿液中8-epi-prostaglandin F2α的含量[31]。

2.4 免疫測(cè)定法

免疫測(cè)定法（Enzyme Immunoassay，簡(jiǎn)稱EIA）也稱作酶聯(lián)免疫測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）。與GC-MS法相比，該法簡(jiǎn)單、快速，不需專業(yè)人員操作。但該技術(shù)也存在著多種缺陷：一是準(zhǔn)確性不好，在測(cè)定樣品中8-iso-PGF2α之前，要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的純化操作，這樣不但費(fèi)時(shí)，而且可能造成目標(biāo)物的流失，導(dǎo)致低回收率；二是特異性差，可能發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，因?yàn)獒槍?duì)8-iso-PGF2α制備的抗體也可能與其他的異構(gòu)體或其代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)；三是結(jié)果誤差大，在測(cè)定過程，尤其是在8-iso-PGF2α與抗體充分結(jié)合期間，樣品中8-iso-PGF2α相關(guān)前體可以繼續(xù)合成目標(biāo)物，導(dǎo)致結(jié)果偏大。

目前，主要是基于該法的原理制備ELISA檢測(cè)試劑盒，將其用于體內(nèi)和體外8-iso-PGF2α的初步檢測(cè)。在制備ELISA檢測(cè)試劑盒用于8-iso-PGF2α測(cè)定時(shí)，利用GC-MS法進(jìn)行了對(duì)比驗(yàn)證，但是并不意味著對(duì)于其他類型的異前列腺素及其代謝物也能夠準(zhǔn)確測(cè)定。總之，該法相對(duì)GC-MS法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、不需要貴重儀器、成本較低和省時(shí)省力等。因此，可將該法用于對(duì)8-iso-PGF2α的含量的初檢，如有必要再次通過GC-MS法進(jìn)行驗(yàn)證，這種特點(diǎn)使其在醫(yī)院中相關(guān)疾病的診斷和治療方面應(yīng)用較多。目前，用于8-iso-PGF2α檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒有北京西美杰科技有限公司推薦的OxiSelectTM8-iso-Prostaglandin F2αELISA Kit（8-isoprostane）試劑盒（目錄號(hào)：STA-337），該試劑盒通過競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)胞漿、尿液、血漿以及組織提取液等多種樣品內(nèi)的8-iso-PGF2α含量。在試劑盒中，還提供了8-iso-PGF2α標(biāo)準(zhǔn)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并有相應(yīng)的8-iso-PGF2α抗體和競(jìng)爭(zhēng)性8-iso-PGF2α-HRP等。樣品經(jīng)ELISA反應(yīng)后可在450 nm處讀取數(shù)據(jù)并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含量。該Kit可完成96次反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便、速度快。

3 結(jié)語

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和自由基能引起機(jī)體代謝紊亂，損傷DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶和生物膜，并導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。補(bǔ)充適當(dāng)?shù)耐庠纯寡趸瘎┛捎行Ы档突蚍乐惯^氧化所導(dǎo)致的氧化損傷的發(fā)生，維持機(jī)體平衡和健康。抗氧化劑可分為兩種：合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。前者主要是二丁基羥基甲苯和丁基羥基茴香醚等，其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且有毒副作用，這些缺陷限制了其應(yīng)用范圍。天然抗氧化劑一般來源于植物，具有高效、低毒和功能齊全的優(yōu)勢(shì)，能夠有效清除自由基、抑制過氧化，使氧化與抗氧化系統(tǒng)維持在平衡狀態(tài)，是當(dāng)前研究開發(fā)的重點(diǎn)。抗氧化劑抗氧化能力的評(píng)價(jià)方法有體內(nèi)和體外抗氧化能力檢測(cè)兩種。建立脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的客觀評(píng)價(jià)方法，有助于對(duì)其機(jī)理的深入研究，不但可以指導(dǎo)如何有效規(guī)避脂質(zhì)過氧反應(yīng)帶來的負(fù)面效應(yīng)，而且可以作為評(píng)估抗氧化劑的效果的重要手段。脂質(zhì)過氧化程度的檢測(cè)方法除了常用的TBA反應(yīng)物法測(cè)定MDA之外，本文綜述了另一種方法，即通過測(cè)8-iso-PGF2α的含量來特異、穩(wěn)定地反映脂質(zhì)過氧化的程度。

8-iso-PGF2α作為脂質(zhì)過氧反應(yīng)的特異性穩(wěn)定產(chǎn)物，是目前公認(rèn)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)狀態(tài)的最有效生物指標(biāo)。在8-iso-PGF2α的測(cè)定方法中，GC-MS法、LCMS/MS法、Immuno-GC-MS法和EIA法均有優(yōu)勢(shì)和不足，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。目前存在的問題是國(guó)內(nèi)外沒有針對(duì)8-iso-PGF2含量測(cè)定的統(tǒng)一的方法，不同方法之間的測(cè)定結(jié)果差距較大，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果難以對(duì)比。因此，建立一個(gè)公眾認(rèn)可的8-iso-PGF2α測(cè)定方法，顯得較為迫切，也是下一步相關(guān)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和突破口。隨著科技的不斷發(fā)展，各種高新技術(shù)不斷地應(yīng)用于樣品的預(yù)處理，這將會(huì)大大簡(jiǎn)化樣品制備程序，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度，同時(shí)也將為建立公認(rèn)的8-iso-PGF2α含量的測(cè)定方法提供技術(shù)支持。

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The Research Progress about Test Methods of 8-iso-prostaglandin F2α

CHEN Wen，MA Ru，LIANG Ruo-nan，LI Cheng-long，YU Xuan，WANG Hao*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Lipid peroxidation have close relationship with a lot of aging and disease，the study of mechanism of LPO and the antioxidant which have an inhibitory effect on，LPO has became a hat spot in food and medicine，et al.8-iso-PGF2αis a Prostaglandins derivative which is formed by pyrolysis of the esterification of arachidonic acid on the cell membrane.8-iso-PGF2αis currently recognized as one of the most effective biomarkers for the evaluation of LPO.Hence，the development of accurate and reliable method for the determination of 8-iso-PGF2αis very critical.LPO，the origin and function as a biomarker of 8-iso-PGF2αwere summarized in this article. Furthermore，the assay method for8-iso-PGF2αwere also highlighted reviewed so as to provide reference for the research work in this field.

8-iso-prostagland in F2α；assay method；Lipid peroxidation；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.031

2013-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201322）；“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃（2012BAD33B05）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃（20100609）

陳文（1984—），男（漢），助理工程師，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通信作者：王浩（1979—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)。