吳朝偉，向 珊，向 敏，袁德培，袁 林

（1.湖北省恩施市中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

三百棒對RA大鼠關節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3表達的影響

吳朝偉1，向 珊1，向 敏1，袁德培2，袁 林2

（1.湖北省恩施市中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

目的：觀察三百棒對完全弗氏佐劑誘導的類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）表達的影響，以探討三百棒治療類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的潛在機制。方法：用弗氏完全佐劑注射于大鼠右后肢足墊皮內(nèi)致炎，制成AA大鼠模型，致炎后第21天開始進行藥物干預4周。免疫組化法檢測膝關節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3表達的水平。結(jié)果：各治療組VEGF、MMP-3的表達明顯低于模型組（P＜0．05）。結(jié)論：三百棒治療類風濕關節(jié)炎的作用機制可能抑制滑膜中VEGF、MMP-3的表達水平相關。

大鼠；類風濕關節(jié)炎模型；三百棒；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-3

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾?。?］。目前對該病的病因病機尚無定論，但研究表明免疫紊亂、細胞因子分泌失常、血管增生、關節(jié)滑膜增厚、軟骨及骨的破壞可最終導致關節(jié)功能喪失。有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在介導血管增生中起主要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases-3，MMP-3）是破壞軟骨及骨的關鍵因素。三百棒（Toddalia asiatica）是湖北土家族地區(qū)廣泛用于治療風濕病的民族藥。我們觀察了三百棒對AA大鼠關節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3的表達，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模

AD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購買于武漢市湖北省疾病防疫控制中心實驗動物中心（合格證號42000600001876），許可證號SCXK（鄂）2008-0005。

除正常組外，其余組每只大鼠于后右足皮內(nèi)注射0.1mL弗氏完全佐劑（FCA）進行造模，造模方法參照參考文獻［2］。各大鼠致炎后24h內(nèi)出現(xiàn)原發(fā)性足趾腫脹高峰，1周腫脹減輕，致炎12天后出現(xiàn)繼發(fā)性足趾關節(jié)腫脹，有些大鼠尾部伴有明顯風濕結(jié)節(jié)。

1.2 藥物及試劑

三百棒根皮采挖于恩施山區(qū)，在湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室分別提取三百棒乙醇提取液和三百棒水提取液，濃縮成1g/mL的藥液，4℃冰箱保存。雷公藤多苷片購買于湖北民族學院附屬民大醫(yī)院門診部，批號120603，將雷公藤多苷片研磨成粉加蒸餾水稀釋成2mg/mL混懸液，放入4℃冰箱保存。弗氏完全佐劑由美國Sigma公司生產(chǎn)，批號Lot#13909。VEGF免疫組織化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，批號130910。

1.3 實驗方法

動物分組及給藥：50只AD大鼠隨機分為：正常組、模型組、雷公藤多苷片治療組（對照組）、三百棒乙醇提取液治療組（三醇組）、三百棒水提取液治療組（三水組），每組10只。致炎后第21天開始進行藥物干預，三醇組和三水組分別給予相應提取液3g/（kg·d）；對照組給于雷公藤多苷片6.3mg/（kg·d），正常組和模型組給與等體積生理鹽水，給藥體積0.01mL/g，連續(xù)4周。

標本采集：各組在末次給藥后（藥物干預28天），禁水禁食一晚，第2天進行標本采集。大鼠進行頸部脫臼處死，然后將大鼠浸泡在新潔爾滅消毒液中5min。于膝關節(jié)正中縱向切開皮膚，暴露膝關節(jié)，在髕骨上緣橫向切斷上面的肌肉和韌帶，在從髕骨兩側(cè)向下分離，然后翻開髕骨，打開膝關節(jié)，可以看見髕骨下緣韌帶上附著一層微黃發(fā)亮的組織，即滑膜組織，用手術(shù)刀將其分離出來。用同樣的方法采集另一側(cè)膝關節(jié)滑膜組織。

免疫組化檢測：將滑膜組織放入石蠟包埋盒中，浸泡在10%福爾馬林中進行固定，脫鈣后進行常規(guī)石蠟包埋切片進行免疫組化實驗檢測滑膜中VEGF、MMP-3的表達水平。實驗操作嚴格按照說明書進行。每張免疫組化切片隨機觀察5個視野并采集圖片，通過計算機圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus6.0）對圖片進行數(shù)據(jù)分析，得出陽性細胞的平均積分吸光度（OD值），計算均值。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

VEGF、MMP-3免疫組化標記均定為于細胞漿，陽性細胞的細胞漿呈棕黃色。由二者免疫組化的圖像可以看見，RA模型組大鼠膝關節(jié)滑膜細胞的胞漿中布滿大量的棕黃色陽性細胞顆粒。正常組滑膜細胞胞漿中棕黃色陽性顆粒分布很少且較均勻。對照組、三醇組、三水組滑膜細胞胞漿中棕黃色陽性細胞顆粒數(shù)量介于正常組和模型組之間，且與模型組相比陽性細胞數(shù)目均有不同程度的減少，見表1。

表1 各組大鼠膝關節(jié)滑膜VEGF、MMP3表達比較 （OD值，±s）

表1 各組大鼠膝關節(jié)滑膜VEGF、MMP3表達比較 （OD值，±s）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n 用藥劑量 VEGF MMP-3正常組 10 - 437.56±15.46 201.06土17.63模型組 10 - 1502.49±76.32#544.67±22.85#對照組 9 6.3mg/（kg·d） 929.89±61.86△423.99土28.19△三醇組 9 3g/（kg·d） 970.94±18.78△432.32±30.08△三水組 9 3g/（kg·d） 1017.34±18.78△436.32±27.08△

3 討 論

目前普遍認為RA是一種血管過度增生性疾病。血管的新生是病理基礎，隨著血管的增生，血管翳的形成，并不斷侵犯軟骨和骨，最終導致關節(jié)畸形功能喪失。實驗證實血管翳形成及對軟骨和骨侵蝕破壞的的重要細胞因子是VEGF、MMP-3［3］。

關節(jié)滑膜中微血管增生是一個復合過程，是很多因子共同作用的結(jié)果，其中VEGF是最為重要的細胞因子。VEGF在RA早期就已經(jīng)出現(xiàn)并持續(xù)存在疾病的全過程。研究發(fā)現(xiàn)RA關節(jié)滑膜最早出現(xiàn)的病理改變就是血管增生，大量炎癥細胞和介質(zhì)，如IL-l、TNF-α等可以上調(diào)VEGF的表達［4］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF水表下降與臨床癥狀改善相關，并與臨床檢測指標血沉、C-反應蛋白含量成正相關，RA早起表達水平越高與后期關節(jié)損傷程度越嚴重，在臨床上應用抗VEGF治療RA能夠延緩疾病的進展，改善臨床癥狀［5］。

研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是在RA發(fā)病過程中起重要作用的酶類，尤其是病變后期介導關節(jié)軟骨和骨的破壞［6］。其中MMP-3是檢測病情活動和預測治療關節(jié)軟骨破壞程度的重要指標之一［7］。研究報道MMP3與RA病情活動相關，與RA患者血清中血沉、C-反應蛋白成正相關，在關節(jié)軟骨破壞中扮演重要角色［8］。目前，RA尚不能根治，后期會導致關節(jié)畸形功能失常，所以防止關節(jié)破壞、保護關節(jié)功能也成為治療RA的目標。只有控制滑膜血管新生，減少關節(jié)軟骨降解，才能達到防治關節(jié)破壞，保護關節(jié)功能的目的。早發(fā)現(xiàn)早治療及時控制病情是減少關節(jié)受損的關鍵。

實驗發(fā)現(xiàn)AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3表達均升高，與正常組相比有顯著差異，表明二者與RA的發(fā)病關系密切。三百棒治療組和雷公藤多苷片治療組，滑膜中VEGF、MMP3的表達都有所降低，和模型組比較有顯著差異，說明三百棒具有與雷公藤多苷片類似的作用，能抑制AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3的表達，抑制關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展，減少血管增生、軟骨降解，從而改善RA病情。

［1］ 葛均波．內(nèi)科學［M］．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：808．

［2］ 李儀奎．中藥藥理實驗方法學［M］．上?？茖W技術(shù)出版社，2006；750-751．

［3］ Konttinen YT，Ainola M，Valleala H，et al．Analysis of 16 different matrix metalloproteinases （MMP-1 to MMP-20） in the synovial membrane：different profiles in trauma and rheumatoid arthritis［J］．Ann．Rheum．Dis，1999，58：691-697．

［4］ 謝建民，余步云，陸才生．VEGF在類風濕關節(jié)炎滑液中的表達及上調(diào)MMP-2活性的研究［J］．中華風濕病學雜志，2006，10（8）：495-497．

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Objective：to observe the effects of Ethnic drugs Sanbaibang （Toddaliae Asiaticae） on VEGF、MMP-3 in Synovial of RA Rats，and explore its potential mechanism.Methods：The AA models were built by injected Freund’s complete adjuvant in right and hind foot of rats.After molding 21th，Giving the medication.To detect the content of VEGF andMMP-3 in Synovial of RA Rats by Immunohistochemistry method.Results：VEGF and MMP-3 in each treatment group was significantly lower than the model group（P＜0.05）.Conclusion：It，s mechanism that may inhibit the VEGF and MMP-3 of Synovial of RA Rats.

Toddaliae Asiaticae；VEGF；MMP-3

R285.6

B

1004-2814（2014）12-1079-02

2014-07-18

國家自科基金（81360672），湖北省醫(yī)學領軍人才培養(yǎng)工程專項經(jīng)費資助

袁 林