皮志媛，王一明，張海蘭，雷程紅

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052；2.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊犁 835000)

李氏桿菌疾病是重要的人畜共患傳染病之一，主要由單核細(xì)胞增多性李氏桿菌引起，呈世界性分布。自1926 年首次分離到該病原以來(lái)，目前已呈世界性分布，作為致病菌和腐生植物致病菌而廣泛存在于環(huán)境中[1-2]。自1995年以來(lái)，先后在新疆石河子、奎屯、精河、哈密、伊犁等地區(qū)暴發(fā)綿羊李氏桿菌病，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了巨大的損失[3]。筆者通過(guò)對(duì)李氏桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用甲醛滅活苗免疫試驗(yàn)動(dòng)物制備特異性抗體，將特異性抗體與抗原進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，建立一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)李氏桿菌病的方法。

1 材料與方法

1.1菌種來(lái)源分離株由伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離獲得。標(biāo)準(zhǔn)株由石河子大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物兔子3只，購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，品種為日本大耳白，無(wú)天然凝集素，且經(jīng)各項(xiàng)體檢級(jí)別為清潔級(jí)。

1.3培養(yǎng)基改良馬丁肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁肉湯瓊脂平板、戊糖發(fā)酵管、硝酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基、甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基、VP試驗(yàn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均按照產(chǎn)品說(shuō)明書配制方法進(jìn)行配制，將pH均調(diào)至李氏桿菌的最佳生長(zhǎng)pH7.0～7.2。

1.4分離菌株的純化將試驗(yàn)室保存的分離菌株在改良馬丁瓊脂平板上劃線，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h，然后挑取生長(zhǎng)良好、邊緣整齊的單個(gè)菌落接種于含5 ml改良馬丁肉湯的試管中，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約14 h，置于4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5抗藥性鑒定將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20 h后觀察并記錄結(jié)果。此次抗藥性試驗(yàn)包括氨芐西林、慶大霉素、左氧氟沙星、多粘菌素、鏈霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉等8種藥敏試驗(yàn)。

1.6高免血清的制備

1.6.1增菌培養(yǎng)。吸取分離純化過(guò)后的菌液10 μl，接種于含50 ml 改良馬丁肉湯的錐形瓶中，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約14 h。

1.6.2菌落計(jì)數(shù)。從增菌后的馬丁肉湯中吸取1 ml菌液，10倍稀釋至10-10，以10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個(gè)濃度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，用以確定菌液中細(xì)菌的含量，并據(jù)此將菌液調(diào)節(jié)至40億/ml。

1.6.3滅活抗原的制備。在調(diào)節(jié)濃度后的菌液中加入一定量的甲醛溶液，使甲醛的最終含量為0.4%，滅活時(shí)間約24 h，在此期間每隔約2 h搖晃1次，以保證滅活完全。滅活后加入佐劑，除第1次加入的為弗氏完全佐劑外，其余均為弗氏不完全佐劑。加入佐劑后，應(yīng)使滅活的菌液與佐劑充分混勻，最終形成“油包水”的結(jié)構(gòu)。

1.6.4免疫試驗(yàn)動(dòng)物。按照0.5 ml/kg體重計(jì)算，給試驗(yàn)兔經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射法第1次接種疫苗。此后每隔7～8 d進(jìn)行1次免疫，共免疫3次。

1.6.5免疫血清的收集。采取心臟采血法，體重2.5 kg家兔1次可取血20～30 ml。取血完畢后馬上將所采集血液分裝入無(wú)菌大試管內(nèi)，斜置，待血液凝固后，置于37 ℃ 恒溫箱中30 min，使血清充分析出，吸取上清于干凈離心管中，于5 000 r/min離心10 min，再取上清液加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉，最終濃度)，測(cè)定抗血清的效價(jià)，封好瓶口，貼好標(biāo)簽，注明抗血清名稱、效價(jià)及日期，置于冰箱中保存?zhèn)溆肹4-7]。

1.7平板凝集方法的建立

1.7.1最佳凝集稀釋度的測(cè)定。抗原共制備成2個(gè)濃度，即原濃度和二倍濃度。先以原菌液10倍稀釋至原濃度的10-10倍，取合適濃度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以確定原菌液中菌體濃度。然后，取1 ml原濃度菌液以3 000 r/min的速度離心10 min，棄去上清液，添加生理鹽水至0.5 ml，即制成二倍濃度的抗原。取8孔玻璃板，用生理鹽水倍比稀釋抗體血清，稀釋成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8共4個(gè)濃度梯度，從左至右依次加至各孔中。在2行孔中1行加入二倍抗原，另1行加入原濃度抗原，在3～5 min內(nèi)讀取結(jié)果。同時(shí)，設(shè)立陰性對(duì)照。凝集反應(yīng)最好的稀釋度即為最佳凝集稀釋度。

1.7.2判定標(biāo)準(zhǔn)。按照下列標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)結(jié)果：若出現(xiàn)“++++”，記為100% 凝集；若出現(xiàn)“+++”，記為75% 凝集；若出現(xiàn)“++”，記為50% 凝集；若出現(xiàn)“+”，記為25% 凝集；以出現(xiàn)“++++”作為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

在陽(yáng)性血清與凝集抗原出現(xiàn)明顯凝集顆粒，陰性血清與凝集抗原之間仍均勻渾濁的前提下，陽(yáng)性血清與待檢抗原出現(xiàn)明顯凝集顆粒，則判為陽(yáng)性；如果均勻渾濁，則判為陰性，介于二者之間，則判為可疑。

1.7.3特異性試驗(yàn)。以副溶血弧菌作為抗原，濃度為最高抗原凝集濃度，用已免疫血清作為抗體，以最佳抗體凝集濃度進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，在3 min內(nèi)觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果[8-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1分離菌株的純化試管內(nèi)容物變得渾濁，顏色稍微變暗，試管底部出現(xiàn)小顆粒狀沉淀，表層有不明顯菌膜，不貼壁生長(zhǎng)，搖晃后底部沉淀混入菌液，菌液更加渾濁，靜置后不久又出現(xiàn)沉淀。

2.2抗藥性試驗(yàn)藥敏結(jié)果按照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI，2006)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，其中，卡那霉素判斷標(biāo)準(zhǔn)參照紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)，頭孢唑林和頭孢噻肟參照青霉素的標(biāo)準(zhǔn)，CLSI未建議使用的藥物僅報(bào)告其抑菌圈直徑，不進(jìn)行敏感性

分析。常用的8種抗菌藥的檢測(cè)結(jié)果表明5株分離菌株對(duì)氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素高度敏感，而對(duì)頭孢唑林、左氧氟沙星、和多粘菌素中度敏感；而對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛鈉耐藥性較強(qiáng)(表1)。

表1 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

注：藥敏片直徑為6.0 mm。

2.3平板凝集試驗(yàn)

2.3.1菌落計(jì)數(shù)。將生長(zhǎng)良好、菌落分散均勻的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表2 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

注：“-”表示菌落數(shù)目多，不可數(shù)。

2.3.2最佳凝集度的測(cè)定。試驗(yàn)所用的血清為經(jīng)3次免疫以后所采集血清，按稀釋梯度凝集后，結(jié)果出現(xiàn)凝集度不一的凝集反應(yīng)，而陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)任何凝集(圖1)。濃縮1倍的抗原和稀釋1倍的血清出現(xiàn)最大強(qiáng)度凝集，據(jù)此可判定血清的最佳凝劑濃度為原血清的2-1。

2.3.3抗體血清的特異性試驗(yàn)。4個(gè)濃度的血清和2個(gè)濃度的抗原進(jìn)行矩陣凝集試驗(yàn)，結(jié)果均不出現(xiàn)任何凝集。由此可見(jiàn)，血清的平板凝集試驗(yàn)具有較強(qiáng)的特異性。

2.3.4平板凝集檢測(cè)。取待檢抗原直接以最高濃度和抗體血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，如發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，即可檢測(cè)、診斷李氏桿菌病。

注：a.陽(yáng)性血清；b.陰性對(duì)照。圖1 最佳凝集濃度的測(cè)定

3 討論

3.1抗藥性試驗(yàn)李氏桿菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，且易產(chǎn)生耐藥性，給臨床治療帶來(lái)很大的困難，所以治療該病時(shí)應(yīng)通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感的抗生素，才能達(dá)到滿意的治療效果。此次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌株對(duì)氨芐西、林慶大霉素、鏈霉素高度敏感，對(duì)頭孢唑林、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感；對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛鈉的耐藥性較強(qiáng)。因此，選用敏感藥物對(duì)發(fā)病畜群進(jìn)行了治療，對(duì)尚未發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行了預(yù)防，即可使病情較快得到控制[10]。

另外，由于李氏桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，故在進(jìn)行該病的治療時(shí)應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間使用同一種或同一類抗生素，以避免或減緩其強(qiáng)耐藥性菌株的出現(xiàn)。在抗生素的選用方面應(yīng)符合用藥標(biāo)準(zhǔn)，注意休藥期，盡量降低畜禽產(chǎn)品中抗生素類藥物的殘留。謹(jǐn)慎使用新一代抗生素，除特別緊急情況外，不使用非常規(guī)藥物治療[11]。

3.2平板凝集試驗(yàn)平板凝集檢測(cè)方法檢測(cè)速度快，一般在3 min內(nèi)作出診斷。Wan J 等[12]設(shè)計(jì)完成的已商業(yè)化的PCR 診斷試劑盒，檢測(cè)LM 的結(jié)果與國(guó)際準(zhǔn)方法(ISO)相當(dāng)，但PCR法需要48 h，而ISO法至少需要5 d。傳統(tǒng)的分離鑒定方法耗時(shí)則更長(zhǎng)。

平板凝集檢測(cè)方法成本低，采用酶免疫分析法(EIA )檢測(cè)血清型1和4b LM “O”和“H”抗原，結(jié)果與凝集試驗(yàn)相一致，但是EIA所需儀器復(fù)雜且用到的試劑比較昂貴。應(yīng)用LLO乳膠凝集分析(LLOLAT)可以檢測(cè)富集培養(yǎng)物包括肉、奶和奶產(chǎn)品中LM 污染[13]，但是LLOLAT步驟較平板凝集復(fù)雜，因此總價(jià)也比平板凝集試驗(yàn)高。Cocolin[14]建立了一種新的檢測(cè)鑒定食品中L.spp和LM 的分子方法，用來(lái)自5個(gè)種的iap( inva 2 sion associated protein)基因擴(kuò)增片段和PCR 產(chǎn)物的變性梯度膠電泳(DGGE)，使5個(gè)種容易得到快速分離和鑒定，這種檢測(cè)方法雖然比較精準(zhǔn)，但是由于其對(duì)成本要求過(guò)高而難以大范圍推廣。

平板凝集檢測(cè)方法結(jié)果穩(wěn)定，Kliger 等在食品檢測(cè)中首先引入了16S rRNA 序列的核酸雜交法，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性。特異性試驗(yàn)表明李氏桿菌平板凝集試驗(yàn)方法具有較強(qiáng)的特異性，因?yàn)榭乖贵w的凝集反應(yīng)具有特異性。特異性可以保證該試驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，表明陽(yáng)性檢出率更接近真實(shí)，誤診的概率更小。

[1] 張勝利.李斯德氏桿菌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病雜志，1993，9(4)：49-51.

[2] 王一明，張海蘭，李靜.新疆部分地區(qū)綿羊及其環(huán)境中單核細(xì)胞增多性李氏桿菌分布狀況的調(diào)查[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，29(3)：90-92.

[3] 剡根強(qiáng)，馬勛，張銀國(guó)，等.新疆部分地區(qū)綿羊李氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001(1)：188-189.

[4] 尚文婧，趙新斐，王靜梅，等.新疆不同來(lái)源單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌分離株的部分生物學(xué)特性及相關(guān)性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(9)：702-706.

[5] 趙新斐，尚文婧，王靜梅，等.不同來(lái)源單核細(xì)胞增多性李氏桿菌inlB 和actA 基因的克隆測(cè)序分析及基因缺失株的毒力試驗(yàn)[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012，20(5)：32-38.

[6] 喬軍，孟慶玲，陳創(chuàng)夫，等.塔里木馬鹿單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的分離與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2008，24(1)：9-11.

[7] 高磊.致綿羊腦炎李氏桿菌在模型小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布及actA、inb 毒力基因的序列測(cè)定[D].石河子：石河子大學(xué)，2010：14-20.

[8] 殷月蘭，張晨菊，田德斌，等.產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌突變株的感染動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37(10)：850-853.

[9] 周曉輝，焦新安.李斯特菌細(xì)胞溶解素在疫苗研制中的應(yīng)用[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003，23(5)：405-406.

[10] 李瑞明，史玉靜，韓濤，等.貉源李氏桿菌的分離與鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40(8)：1094.

[11] 張亞軍，劉漢民，陶吾皮，等.綿羊李氏桿菌病的病例報(bào)告[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48(12)：79.

[12] WAN J，KING K，F(xiàn)ORSYTH S，et al.Detection of Listeria monocyto 2 gene in salmon using the Probelia polymerase chain reaction system[J].J Food Prot，2003，66(3)：436-440.

[13] MATAR G M，HAYES P S，BIBB W F，et al.Listeria lysine O-based latex angulations test for the rap id detection of Listeria monocytogenes in foods[J].Journal of Food Protection，1997，60(9)：1038-1040.

[14] COCOLIN L，RANTSION K，IACUMIN L，et al.Derect identification in food samples of Listeria spp.and Listeria monocytogenes by molecular methods[J].Appl Microbial，2002，68(12)：6273-6282.