趙曉丹，曹雁平，張 祿

（1.北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京100048；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040）

大蒜綠變是一種常見的加工現象。長期的生活實踐證明，大蒜綠變物質對人體是安全的，但綠變物質具體為何種物質尚屬未知。近年來，一些學者對大蒜綠變機理及綠變物質進行了相關研究。一些研究對綠變產物的組成和性質進行了探索，目前認為綠變色素由藍色素和黃色素兩種成分混合組成，故而呈現綠色，其紫外可見吸收峰在440nm和590nm[1]。有學者在部分純化的基礎上對色素的結構進行了推測，認為大蒜綠色素可能是一種含氮類色素，性質與花青素有許多相似之處，具有多個吡咯環(huán)，含有一個硫原子[2]，當吡咯環(huán)的聚合度增加時，其顏色由紫紅向藍、綠、黃方向改變[3]。目前認為大蒜綠變過程是大蒜中丙烯基半胱氨酸亞砜在酶類（蒜氨酸酶和γ-谷氨酰轉肽酶）作用下轉化為硫代磺酸酯[4-5]，而后與氨基酸[6-7]等物質反應形成了綠變產物，可見綠變產物可能是由含硫化合物轉化而來。還有的學者試圖對色素進行人工合成[8]，以期從另一個角度揭示其結構信息，同時也為綠變色素的開發(fā)利用奠定基礎。在綠變物質的研究過程中，常需要對色素進行提取、濃縮及多次純化等處理來獲得高純度色素提取物，再對其深入研究，因此提高色素提取物的制備效率尤為必要。研究顯示SephadexLH-20[1-9]等進口分離介質對色素的分離效果較為理想但易被污染，從而影響分離效果，在其之前最好進行初級分離除去雜質，才能保證這類介質的分離效率和使用壽命。大孔樹脂成本低，處理量大，操作條件溫和，本研究采用SIPI-40大孔樹脂直接對色素水提取液進行吸附分離，通過實驗優(yōu)化確定了分離操作條件，通過大孔樹脂的吸附富集作用，可以快速的將綠變物質與大多數雜質分離，減少了對后續(xù)分離的干擾；同時保持綠變產物的性質，并達到濃縮的目的。是一種高效快速制備綠變色素提取物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫皮大蒜 購于當地超市；大孔樹脂AB-8、NKA-9及S-8 購于南開大學化工廠；SIPI-40 為上海華震公司產品；其他常規(guī)化學試劑 均為國產分析純。

UV 762紫外/可見分光光度計 為上海精密科學儀器有限公司產品；FD-1E-50冷凍干燥機 為北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜綠變色素粗提液的制備 將大蒜用5%醋酸室溫浸泡約一周，待大蒜變成藍綠色取出做實驗原料。將綠變大蒜打碎，用80%乙醇提取∶料液比（1∶5），提取溫度25℃，提取時間5h；提取兩次，合并提取液。將提取液真空旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮液用乙酸乙酯萃取兩次，靜置分層后棄去上層，留取下層色素濃縮液備用[1]。用蒸餾水稀釋色素濃縮液，調節(jié)其吸光值A590在0.5～0.6之間，即得樹脂純化實驗中的色素粗提液試樣；以A590作為粗提液中綠變色素濃度的衡量指標。

1.2.2 大孔樹脂的篩選 每種樹脂準確稱取5g，加入制備好的色素提取液50mL，于100mL三角瓶中，置于搖床振蕩24h（25℃，100r/min），過濾，測定濾過液吸光值A5901；吸附前色素粗提液吸光值記為A5900；用蒸餾水洗滌樹脂表面，再各用50mL 90%乙醇溶液于相同條件下解吸，過濾，測定解吸液吸光值記為A5902。吸附率及解析率計算公式如下[10]：

1.2.3 大孔樹脂純化綠變色素的條件優(yōu)化 將預處理后的SIPI-40樹脂裝入1cm×30cm的柱中，樹脂柱床體積（BV）20mL，待柱平衡后，取一定量按前述方法制備的色素粗提液，在不同條件下通過樹脂柱，以確定最佳的上樣體積、上樣流速、洗脫劑濃度和洗脫劑體積。

1.2.3.1 最佳上樣體積 將色素提取液以1mL/min流速通入樹脂柱，同時收集透過液，每5mL為一管，測定每管透過液的A590，以其為縱坐標，以透過液體積為橫坐標，繪制吸附曲線[11]，根據曲線確定最佳上樣量。

1.2.3.2 最佳上樣流速 取五份體積為2BV的色素提取液，分別以0.5、1、1.5、2及2.5mL/min的流速通入樹脂柱，收集透過液并測定其A590，計算不同流速下的吸附率，確定上樣流速。

1.2.3.3 洗脫劑濃度 各取2BV的色素提取液上柱，吸附1h，然后用3BV的蒸餾水洗脫，再分別用20%、40%、60%、80%、90%乙醇溶液及含0.1%HCl的90%乙醇溶液乙醇洗脫4BV，收集洗脫液，濃縮至2BV，測定洗脫液A590，計算解吸率。

1.2.3.4 洗脫曲線繪制 取2BV的色素提取液溶液上柱，流速1ml/min，先用3BV的蒸餾水洗脫，再用酸化的90%乙醇進行洗脫，每5mL收集一管，并測定各管洗脫液A590，以洗脫液體積為橫坐標，各收集管中洗脫液A590為縱坐標，繪制洗脫曲線，收集色素富集區(qū)域的洗脫液，即為色素純化物；將這部分色素純化物濃縮凍干，得干燥的色素粉末，-20℃保存。

1.2.4 色素提取物純度的評價 由于大蒜綠變色素的結構尚未明晰，無法通過與標準品對照來準確定量，其提取物的純度通常以色價來衡量。色價的測定過程及計算方法依據參考文獻進行[10]。具體如下：稱取純化前色素粗提物及純化物固態(tài)樣品各0.05g，用pH3.0的HCl溶液溶解，定容至100mL。取1cm比色皿，以HCl溶液為空白，在波長590nm下測定吸光度A。

色價的計算公式如下：

式中：A，樣品的吸光度；r，稀釋倍數；m，樣品的質量（g）；E，色價。

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂的篩選結果

表1 不同大孔樹脂對綠變色素的吸附及解吸效果Table 1 Absorption and desorption capabilities of different macroporous resin to garlic greening compounds

樹脂對色素的吸附效率的不同與樹脂本身的性質有關。S-8屬于強極性樹脂，NKA-9、SIPI-40樹脂屬于中等極性樹脂，AB-8屬于弱極性樹脂。前期研究表明，綠變色素屬中等極性物質，因此選擇上述幾種已得到廣泛應用的極性樹脂來對綠變物質進行分離純化。由表1中數據可知，在靜態(tài)吸附和解吸實驗中，幾種極性樹脂對于大蒜綠變物質均具有一定的吸附效果，其中以SIPI-40的吸附率最高，達到91.9%；解吸率為84.7%。因此選擇SIPI-40樹脂作為介質進一步優(yōu)化其分離條件。SIPI-40在其他中等或弱極性物質的分離中也得到了較好應用，彭益強等曾利用SIPI-40樹脂從酶解液中吸附分離了1，3-丙二醇[12]。

2.2 SIPI-40樹脂純化綠變物質的條件優(yōu)化

在樹脂分離條件優(yōu)化實驗中，以綠變色素的粗提液為試液，測定其吸附前后的吸光值A590的變化，并按前述方法計算吸附率及解吸率。繪制動態(tài)吸附及解吸曲線時，以A590為考察指標。

2.2.1 最佳上樣量的確定 當樹脂吸附飽和后，繼續(xù)增加上樣量會產生目標吸附物質的泄露現象。SIPI-40對大蒜綠變色素的吸附曲線如圖1所示，以透過液的吸光值A590為指標考察透過液中色素物質的濃度。由圖1中數據可知，當上樣體積達到2BV后，隨著進樣量的增加，透過液的A590逐漸增加；當進樣超過4BV，透過液中色素含量顯著增加，泄露現象明顯?？梢娺M入樹脂床的提取液體積超過2BV時，樹脂對綠變物質的吸附開始趨于飽和，因此上樣量定為2BV。

圖1 SIPI-40樹脂對綠變色素的動態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of Garlic greening compounds on SIPI-40 resin

2.2.2 最佳上樣流速的確定 樹脂對色素的動態(tài)吸附效果與其接觸時間有關，因此上樣時樣液的流速決定了吸附率的高低。圖2所示為不同的進樣流速下，樹脂對色素的吸附率?？梢?，隨著流速的增加，樹脂對色素的吸附率逐漸下降，當流速為0.5mL/min和1mL/min時，吸附率分別為94.3%和92.8%，考慮到實際操作效率，選擇上樣流速為1mL/min。

圖2 上樣流速對樹脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of injecting velocity on adsorption rate of garlic greening compounds

圖3 不同洗脫溶劑對色素的解吸效果Fig.3 Desorption rate of garlic greening compounds by Macroporous Resin different eluent

2.2.3 最佳洗脫溶劑的確定 不同洗脫劑對綠變色素的解吸效果如圖3所示，隨著乙醇濃度的提高，洗脫劑對色素的洗脫能力逐漸增強，在乙醇濃度達到90%時，解析率為87.4%。為提高解吸效果，在此采用了向洗脫劑中加入助劑的方式提高解吸效果，經過實驗證實，加入低濃度的鹽酸（0.1%）可以顯著提高解析率。前期研究表明，色素在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此加入鹽酸不會影響色素的性質。最終選擇含有0.1%HCl的90%乙醇溶液為洗脫劑。

2.2.4 洗脫曲線及洗脫液體積的確定 色素粗提液在SIPI-40樹脂柱床上按上述確定的操作條件進行上樣，吸附和水洗，然后在1mL/min的洗脫流速下采用酸化的90%乙醇溶液對色素進行解吸。洗脫過程中，每5ml洗脫液收集為1管，洗脫液所用體積為4BV（80mL），共計16管。測定每管吸光值A590，以其為縱坐標，以洗脫液體積（以BV計）為橫坐標繪制洗脫曲線。洗脫曲線如圖4所示，由圖4可見，隨著洗脫的進行，收集管中洗脫液的A590開始逐漸增加，色素逐漸被解吸下來，洗脫液為1.5BV時，A590達到0.143，色素開始被大量解吸。整個洗脫曲線呈峰形，說明目標分離物在尖峰處得到了富集。當洗脫液體積達到3BV時，A590已下降為0.140左右，濃度較低；繼續(xù)洗脫，洗脫液吸光值繼續(xù)下降，因此設定整個洗脫體積為4BV，解吸可基本完成。根據曲線收集1.5BV到3BV這一階段的洗脫液，該部分為綠變色素經過樹脂富集純化后得到的濃縮區(qū)帶，適用于后續(xù)研究。

綜合以上研究結果，SIPI-40樹脂富集分離大蒜綠變物質的最佳操作條件為：首先控制進樣的色素粗提液濃度使其A590為0.55左右，最大進樣量為2BV，進樣流速1mL/min，洗脫劑為含0.1%HCl的90%乙醇溶液，洗脫劑用量為4BV，洗脫液體積為1.5～3BV部分得到的洗脫液為色素富集帶，收集這部分洗脫液，濃縮凍干得到色素純化物粉末。

表2 SIPI-40樹脂純化前后的大蒜綠變色素提取物的色價Table 2 Color value of the garlic greening compound extracts before and after the separation

2.2.5 色素純化物純度評價 表2中的結果顯示，未經樹脂柱純化的色素粗提液的凍干粉末的色價為10.4，主要是其中含有較高比例的雜質，如糖類等。經過樹脂柱的吸附純化后，大多數雜質與色素組分得到了很好的分離，純化產物的色價為47.6，色素純度大大提高。

3 結論

本研究采用SIPI-40樹脂對大蒜綠變色素進行了初步的富集分離，確定了樹脂分離的最佳條件：以0.5mg/mL的色素提取物水溶液進樣，最大進樣體積為2BV（柱床體積），進樣流速1mL/min，洗脫劑為含0.1%HCl的90%乙醇溶液，洗脫體積為4BV，在此操作條件下測得的洗脫曲線峰形理想；純化后的色素提取物的色價提高到47.6，可見大孔樹脂SIPI-40可以實現對大蒜綠變色素的富集純化。色素組分經樹脂法富集分離后，可進一步選用適宜的分離手段完成對其的高度純化，進而研究其結構信息及相關性質。

[1]趙曉丹，傅達奇，王萍，等.臘八蒜綠變色素的分離提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：129-131.

[2]Lee E J，Cho J E，Kim J H，et al.Green pigment in crushed garlic（Allium sativum L.） cloves：purification and partial characterization[J].Food Chemistry，2007，101（4）：1677-1686.

[3]Imai S，Akita K，Tomotake M，et al.Identification of two novel pigment precursors and a reddish-purple pigment involved in the blue-green discoloration of onion and garlic[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（3）：843-847.

[4]Kubec R，Veli?ek J.Allium discoloration：The color-forming potential of individual thiosulfinates and amino acids：Structural requirements for the color-developing precursors[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（9）：3491-3497.

[5]Roman K，Marcela H，Rabi A.Allium discoloration：precursors involved in onion pinking and garlic greening[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（16）：5089-5094.

[6]Cho J E，Lee E J，Yoo K S.Identification of candidate amino acids involved in the formation of blue pigments in crushed garlic cloves（Allium sativum L.）[J].Journal of Food Science，2009，74（1）：C11-C16.

[7]Jungeum CHO，Eun J L，Kil S Y，et al.Identification of candidateamino acidsinvolved in the formation ofblue pigments in crushed garlic cloves（Allium sativum L.）[J].Journal of Food Science，2009，74（1）：C11-C16.

[8]Wang D，Nanding H，Han N，et al.G.2-（1Hpyrrolyl）carboxylic acids as pigment precursors in garlic greening[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（4）：1495-1500.

[9]王巖，喬旭光.大蒜綠變物質提取及其分離純化方法的初步研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（4）：115-117.

[10]李偉，姜媛，唐曉珍，等.大孔樹脂純化黑粒小麥麩皮色素及其初步鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（8）：200-204.

[11]鄢貴龍.大孔樹脂對葛根素吸附行為的研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（1）：63-66.

[12]彭益強，蘭琳，陳巍，等.吸附樹脂在酶法制備1，3-丙二醇中的應用[J].精細化工，2008，25（5）：463-467.