王 燕，郭文龍，耿德海，王 波，張建立，張艷敏，劉淑卓

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071000；2. 淶水縣縣醫(yī)院，河北 淶水074100；3. 易縣縣醫(yī)院，河北 易縣074200；4. 易縣中醫(yī)院，河北 易縣 074200；5. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

精子發(fā)生過(guò)程中調(diào)控性非編碼RNAs的功能

王 燕1，郭文龍2，耿德海2，王 波3，張建立3，張艷敏4，劉淑卓5

（1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071000；2. 淶水縣縣醫(yī)院，河北 淶水074100；3. 易縣縣醫(yī)院，河北 易縣074200；4. 易縣中醫(yī)院，河北 易縣 074200；5. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

精子數(shù)量下降和質(zhì)量減低是全球范圍內(nèi)男性不育疾病增加的主要原因。因此理解精子發(fā)生及其調(diào)控的分子機(jī)制是非常必要的。精子發(fā)生主要分為有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段，這些過(guò)程被階段特異性的基因表達(dá)嚴(yán)格調(diào)控，而眾多的調(diào)控性非編碼RNAs則是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。飛速發(fā)展的基因組檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，調(diào)控性非編碼RNAs在不同生物演化和疾病進(jìn)程中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其包括微小RNA(miRNA)、小干擾RNA（siRNA）、與PIWI蛋白相互作用的RNAs（piRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）。討論這些轉(zhuǎn)錄本在精子發(fā)生中的功能作用，并綜述其異常表達(dá)與相關(guān)疾病的關(guān)系。

調(diào)控性非編碼RNAs；精子發(fā)生；基因表達(dá)；男性不育

精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的分化過(guò)程，包括精原細(xì)胞的有絲分裂增殖、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精細(xì)胞經(jīng)過(guò)變態(tài)過(guò)程形成精子三個(gè)階段。這一過(guò)程受多種表觀遺傳機(jī)制共同調(diào)控，其中調(diào)控性非編碼RNAs的功能越來(lái)越得到人們的重視。占據(jù)人類基因組98.5%的非蛋白編碼序列中，絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成調(diào)控性非編碼RNAs，這些RNAs在多個(gè)層面上參與精子發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控，并與男性不育等人類重大疾病密切相關(guān)?，F(xiàn)綜述精子發(fā)生過(guò)程中調(diào)控性非編碼RNAs的作用機(jī)制，為男性不育的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 miRNA與精子發(fā)生

miRNA為長(zhǎng)度21～25個(gè)核苷酸不等的內(nèi)源性非編碼RNA。大多數(shù)小RNA基因首先在RNAPol II作用下先轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNA，然后在RNase III酶Drosha和雙鏈RNA綁定蛋白DGCR8組成的核微處理器復(fù)合體作用下形成70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA前體，DGCR8可識(shí)別RNA底物，而Drosha則具有核酸內(nèi)切酶的作用[1]。隨后，miRNA前體物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)，被核酸內(nèi)切酶Dicer進(jìn)一步處理成21～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的成熟小雙鏈miRNA。最后成熟的miRNA與AGO蛋白和其它輔助蛋白結(jié)合形成RNA誘發(fā)沉默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC）[2]。通過(guò)miRISC、miRNA調(diào)節(jié)靶mRNA，使其降解或翻譯抑制。精子發(fā)生過(guò)程中，miRNA調(diào)控機(jī)制在調(diào)節(jié)雄性生殖細(xì)胞分化過(guò)程中基因階段特異性表達(dá)上具有重要作用。miRNA微陣列、RT-PCR或小RNA序列研究證實(shí)，miRNA高度、廣泛、優(yōu)先的表達(dá)在睪丸和雄性生殖細(xì)胞分化的各個(gè)階段[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，在精原干細(xì)胞、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子中可以表達(dá)幾種相同的miRNA，但也有一些miRNA表達(dá)在某些特定的細(xì)胞類型中。如miR-34c既存在于精原干細(xì)胞中，調(diào)控其狀態(tài)，又在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中高度表達(dá)，在精子發(fā)生后期發(fā)揮重要作用[5]。

2 siRNA與精子發(fā)生

siRNA為長(zhǎng)度21～28個(gè)核苷酸不等的內(nèi)源性非編碼RNA。與miRNA不同的是，siRNA源于長(zhǎng)雙鏈RNA，在生成過(guò)程中不需要核微處理器復(fù)合體的作用，而是直接在核酸內(nèi)切酶Dicer的催化下形成成熟的siRNA。Song等[6]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA在小鼠雄性生殖細(xì)胞中高度表達(dá)，睪丸RNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)鑒別了73種siRNA，其中絕大多數(shù)分布在不同染色體的幾個(gè)至幾百個(gè)不同的位點(diǎn)上，這種分布情況表明其不僅可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的RNA，也可影響核內(nèi)染色質(zhì)修飾。siRNA的作用靶點(diǎn)92%為mRNA，4%為非編碼RNAs，3%為假基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1%為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[4]。siRNA誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱為RNA干擾，此技術(shù)能有效抑制精子發(fā)生過(guò)程相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而研究這些基因的功能作用。精子發(fā)生早期，利用siRNA抑制Bcl6b、Ets相關(guān)分子和LIM同源框1的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)精原干細(xì)胞的自我更新受到影響，表明這些轉(zhuǎn)錄因子是精原干細(xì)胞自我更新所需的關(guān)鍵因子[7]；利用siRNA沉默Gfra1基因，小鼠精原干細(xì)胞會(huì)從自我更新轉(zhuǎn)而分化為A1-A4型精原細(xì)胞，表明Gfra1可抑制精子發(fā)生[8]；利用siRNA敲除Nodal基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，表明Nodal可抑制細(xì)胞凋亡[9]; 精子發(fā)生晚期，通過(guò)siRNA特異性敲除Slx和SlxL1基因，發(fā)現(xiàn)小鼠生育力明顯下降[10]。在支持細(xì)胞中，利用siRNA敲除Pard6a或Part3基因，發(fā)現(xiàn)血睪屏障相關(guān)蛋白表達(dá)減少，表明其具有重建血睪屏障的作用[11]，此外siRNA還可抑制beta-1整聯(lián)蛋白，導(dǎo)致支持細(xì)胞之間閉鎖蛋白的再分配和血睪屏障的失衡，易誘發(fā)男性不育等相關(guān)疾病[12]。

3 piRNA與精子發(fā)生

2006年Aravin等[13]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與PIWI蛋白互相作用的RNA，稱為piRNA。這種RNA構(gòu)成了調(diào)控性非編碼RNAs的重要組成部分，在雄性生殖細(xì)胞中占主導(dǎo)地位。piRNA為24～30個(gè)核苷酸不等的單鏈RNA，其合成不需要核微處理器復(fù)合體和Dicer酶的催化。Jodar等[14]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中的piRNA成簇富集在基因組中，長(zhǎng)度可達(dá)100 kb，廣泛參與雄性生殖細(xì)胞發(fā)育、表觀遺傳調(diào)控和移動(dòng)元件抑制等過(guò)程。精子發(fā)生過(guò)程中，piRNA可抑制移動(dòng)轉(zhuǎn)位因子的激活過(guò)程，其缺失可能誘發(fā)精子發(fā)生障礙[15]。piRNA的功能由其綁定的PIWI蛋白所調(diào)控，在大鼠中有三種PIWI亞家族成員，分別是PIWIL1/MIWI，PIWIL2/MILI和PIWIL4/MIWI2[16]。MILI主要存在于精原細(xì)胞到粗線期精母細(xì)胞階段，MIWI則存在于粗線期精母細(xì)胞到圓形精子細(xì)胞階段。任何一個(gè)PIWI蛋白異常都會(huì)影響精子發(fā)生過(guò)程，造成精子DNA損傷和生殖細(xì)胞凋亡。郭翠翠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，分別敲除雄性小鼠的MIWI、MIWI2和MILI的純合子，會(huì)造成生精停滯和生殖細(xì)胞凋亡，然而分別敲除雌性小鼠的MIWI、MIWI2和MILI的純合子，其仍能產(chǎn)生正常后代，表明MIWI、MIWI2和MILI特異性作用于雄性生殖細(xì)胞，影響雄性生殖細(xì)胞的分化和成熟。近期研究[18]發(fā)現(xiàn)，磷脂酶D可影響piRNA的生成過(guò)程，其突變會(huì)使精子發(fā)生過(guò)程停滯在減數(shù)分裂階段。此外，Gu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PIWI基因的遺傳多態(tài)性也會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生缺陷，進(jìn)而影響男性的生育能力。

4 lncRNA與精子發(fā)生

lncRNA為長(zhǎng)度200 ～10 000個(gè)核苷酸的調(diào)控性非編碼RNAs，其通過(guò)與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能。基因組計(jì)劃研究顯示，人類基因組絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為非編碼RNAs，其中l(wèi)ncRNA所占的比例最大，其基因有10 000～20 000個(gè)，廣泛分布在整個(gè)基因組中[20]。通常按照其功能將他們劃分在相關(guān)蛋白質(zhì)編碼基因的對(duì)應(yīng)位置，包括鏈方向不能被直接測(cè)定的基因內(nèi)區(qū)或基因間區(qū)以及來(lái)自反鏈、假基因和轉(zhuǎn)座子的外顯子區(qū)。精子發(fā)生過(guò)程部分受到lncRNA的調(diào)節(jié)[21]，其中一些lncRNA是反義轉(zhuǎn)錄本，當(dāng)睪丸中的反義轉(zhuǎn)錄本增高時(shí)，會(huì)使基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制更加嚴(yán)格[22]。 lncRNA通常在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮其調(diào)控機(jī)制。在轉(zhuǎn)錄水平上，其通過(guò)促進(jìn)特定組蛋白修飾來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用，如HOTAIR（Hox轉(zhuǎn)錄本反義RNA）通過(guò)募集PRC2到HoxD位點(diǎn)從而抑制組蛋白H3修飾來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程[23]。在剪接過(guò)程中，lncRNA也可在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮作用，如MALAT1（轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1）通過(guò)與剪接因子相互作用來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的選擇剪接[24]。此外，精子中的lncRNA會(huì)呈現(xiàn)出與預(yù)期不同的亞型，主要是因?yàn)槠鋪?lái)源于體細(xì)胞的表達(dá)。然而，精子中的lncRNA比睪丸更豐富，這種lncRNA在精子成熟、受精和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能作用還有待進(jìn)一步研究。

5 問(wèn)題與展望

生殖細(xì)胞將其遺傳和表觀遺傳信息傳遞給下一代的能力高度表明正確的表觀遺傳標(biāo)記建立與維持的重要性。廣泛并準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)精子發(fā)生各階段中特異性基因的有序表達(dá)是至關(guān)重要的。隨著基因組計(jì)劃的完成，人們對(duì)調(diào)控性非編碼RNAs的認(rèn)識(shí)不斷加深。這些非編碼RNAs作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，對(duì)各種生物學(xué)過(guò)程中基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用。miRNA、siRNA、piRNA和lncRNA協(xié)同作用是雄性生殖細(xì)胞中基因表達(dá)和染色質(zhì)重塑調(diào)控的主要機(jī)制之一。目前全球范圍內(nèi)男性不育疾病升高的趨勢(shì)已經(jīng)引起了生殖醫(yī)學(xué)專家的廣泛關(guān)注，遺傳和環(huán)境因素均可導(dǎo)致男性生育能力下降甚至不育，目前大多采用輔助生殖技術(shù)進(jìn)行治療。表觀遺傳重編程貫穿于精子發(fā)生的整個(gè)過(guò)程，其對(duì)精子的正常發(fā)育非常重要,然而并不知道跨代遺傳是否會(huì)造成關(guān)鍵分化過(guò)程的錯(cuò)誤傳達(dá)。由于調(diào)控性非編碼RNAs是精子發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)和表觀遺傳事件的重要調(diào)控因子，他們可以作為男性不育疾病診斷的生物標(biāo)志物，并且可以為男性不育治療方法的選擇提供理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯：劉俊華）

The role of regulatory non-coding RNAs during spermatogenesis

WANG Yan1, GUO Wenlong2, GENG Dehai2, WANG Bo3, ZHANG Jianli3, ZHANG Yanmin4, LIU Shuzhuo5
(1. College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Laishui County Hospital, Laishui 074100, China; 3. Yixian County Hospital, Yixian 074200, China; 4. Yixian County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yixian 074200, China; 5. Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China)

Global rise in male infertility as a result of falling sperm count and quality has been pointed out by many investigations. Therefore, it is essential to understand the molecular mechanism of spermatogenesis and its regulation. Spermatogenesis is characterized by three phases: mitosis, meiosis and spermiogenesiss, which are strictly regulated by phase-specific gene expression that is controlled by myriads of regulatory non-coding RNAs. Rapid advancement in genome mining technologies has identified role of regulatory non-coding RNAs including microRNA(miRNA), small-interfering RNA(siRNA), PIWI-interacting RNA(piRNA) and long noncoding RNA(lncRNA) as controllers of gene expression at transcriptional as well as post-transcriptional level in different biological context and disease processes. Here, we discuss the recent advances in our understanding about the involvement of these transcripts in spermatogenesis. In addition, we review here the relationship between their abnormal experssion and associated diseases.

regulatory non-coding RNAs; spermatogenesis; gene expression; male infertility

R69

A

1674-490X(2014)06-0095-05

2014-11-24

王燕（1974—），女，滿族，河北易縣人，副教授，碩士，主要從事生殖毒理學(xué)教學(xué)和科研。E-mail：wyry2004@163.com,

劉淑卓（1971—），女，河北保定人，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)。E-mail: cimeiliuxiang@126.com