王長征，周中銀，羅和生

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，其臨床特點是反復(fù)發(fā)作與緩解。在世界范圍內(nèi)，每年約有3～20/10萬新發(fā)病例［1］。UC對人類健康影響較大，且為結(jié)腸癌的高危因素。為進一步認識炎癥性腸病的發(fā)病機制，合適的動物模型是必不可少的。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎的動物模型與人類UC有許多相關(guān)的表型特征［2］。目前尚無準(zhǔn)確分析DSS誘導(dǎo)小鼠實驗性結(jié)腸炎模型的臨床及組織病理學(xué)特點的文獻報道?；诖?，我們研究了DSS誘導(dǎo)小鼠實驗性結(jié)腸炎模型在不同時間段的臨床特點和組織病理學(xué)改變。以便于指導(dǎo)我們選擇理想的UC小鼠模型。

1 材料與方法

1．1 動物 雄性野生型C57BL/6成年小鼠，體質(zhì)量(25．0±5．0)g，由湖北實驗動物中心提供。實驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予自然光照、(20±3)℃條件。標(biāo)準(zhǔn)實驗室配方食物，自由進食和飲水。

1．2 動物模型構(gòu)建及分組 急性結(jié)腸炎誘導(dǎo)給予口服3%DSS(分子量:54 000，由Sigma公司提供)溶液，DSS水每日更換。取50只小鼠隨機分為5組，飲用純凈水為D0組;飲用3%DSS溶液共3 d為D3組;飲用3%DSS溶液共5 d為D5組;飲用3%DSS溶液共7 d為D7組;飲用3%DSS溶液共10 d為D10組，每組10只小鼠。

1．3 觀察指標(biāo) 記錄小鼠糞便潛血、血便、體質(zhì)量和小鼠死亡情況。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)的評定見表1。疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻［3］。結(jié)腸組織學(xué)損傷的評估:每組小鼠飼養(yǎng)到設(shè)定時間后，乙醚麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死，剖腹，取肛門至回盲部的結(jié)腸，沿腸系膜邊緣縱行剖開腸腔，生理鹽水沖洗糞便，在解剖鏡下觀察結(jié)腸大體形態(tài)。每只小鼠取距肛門相同距離處同一部位組織標(biāo)本(2 mm×10 mm)，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片(4 μm)，蘇木精-伊紅染色，兩位病理學(xué)專家盲法閱片計分。組織學(xué)損傷程度用炎癥、病變深度、隱窩破壞評分與病變范圍評分的乘積表示。小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)參見文獻［4］。

表1 DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Scoring of DAI in DSS-induced acute colitis in m ice

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般情況 DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠第3天開始出現(xiàn)稀便、大便潛血陽性及明顯體質(zhì)量下降;第5天開始出現(xiàn)了血便;第10天開始出現(xiàn)死亡小鼠，小鼠死亡率為30%。DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎造模過程臨床特點見表3。各組小鼠DAI評分比較見圖1。

2．2 大體形態(tài) DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠黏膜病變從肛門側(cè)自下向上連續(xù)性發(fā)展，逐漸減輕，直腸最為嚴(yán)重，近端結(jié)腸幾乎正常，病變部黏膜呈中、重度充血水腫，散在糜爛、淺潰瘍。

表2 小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Histological injury score standard in DSS-induced acute colitis in m ice

表3 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎造模過程臨床特點Tab 3 Clinical findings of DSS adm inistration in the acute colitis

圖1 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型疾病活動指數(shù)－時間變化過程Fig 1 DAI in the course of DSS-induced acute colitis in m ice

2．3 光鏡下病理形態(tài) 造模前野生型小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)和黏膜都沒有損害，野生型小鼠結(jié)腸炎造模第3天黏膜上皮細胞開始逐漸喪失，第7～10天最為嚴(yán)重;與此同時，隱窩結(jié)構(gòu)的紊亂從第3天開始發(fā)生，第7天出現(xiàn)固有層塌陷;炎性細胞浸潤從第3天開始數(shù)量逐漸增加，第10天最為嚴(yán)重。各組小鼠結(jié)腸組織病理計分比較見圖2。DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理光鏡下改變見圖3。

3 討論

UC的許多研究成果來源于動物體內(nèi)的研究，因而了解UC動物模型的臨床特點和結(jié)腸組織病理特征對UC的研究非常重要［5］。DSS是一種人工合成硫酸多糖體，具有和肝素一樣的抗凝血作用。DSS近年來常用于誘導(dǎo)UC動物模型［6］。本實驗應(yīng)用3%DSS溶液，給小鼠自由飲用，連續(xù)10 d，出現(xiàn)遠端結(jié)腸急性炎癥表現(xiàn)。病理及臨床表現(xiàn)與UC相似，說明DSS誘導(dǎo)的動物模型適合UC的研究。

圖2 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理評分－時間變化過程Fig 2 Histologic score in the course of DSS-induced acute colitis in m ice

圖3 DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織病理改變(HE，100×)Fig 3 Histological analysis of DSS adm inistration in the acute colitis(HE，100×)

DSS溶液5 d后主要表現(xiàn)為腹瀉、血便、體質(zhì)量下降、懶動等。光鏡下組織病理學(xué)改變主要為全結(jié)腸多灶性淺潰瘍、隱窩破壞和繼發(fā)黏膜、黏膜下層炎癥，少數(shù)病灶炎癥可侵及漿膜層，浸潤的炎癥細胞以中性粒細胞為主，伴少量淋巴細胞和單核細胞。這些急性結(jié)腸炎癥改變與文獻報道的病變相似［7］。

從病理變化過程發(fā)現(xiàn)，DSS制模后第3天就表現(xiàn)出明顯的腸道損傷，病理改變在第5天后明顯加重，并且在制模后第7天病理改變到達高峰，這與有關(guān)文獻報道是一致的［8］。因此，DSS制模第7天可用于急性炎癥性損傷的研究。從研究中我們注意到，在制模第10天小鼠有一定的死亡率(30%)，而在制模第7天腸道急性損傷的特點已經(jīng)很明顯，沒有動物死亡發(fā)生。分析小鼠制模后一般表現(xiàn)情況，與腸道病理變化過程是相符的。因此，選擇在制模第7天進行急性腸道損傷的研究比較理想。

從已有的文獻報道［9］和我們的實驗結(jié)果可以看出，3%DSS誘導(dǎo)野生型C57BL/6成年小鼠作為實驗性結(jié)腸炎的動物模型實驗周期短，方法簡單，制作簡便、經(jīng)濟，易于復(fù)制，動物耐受性好，制模成功率高，是研究UC發(fā)病機制和藥物治療較理想的工具。

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