黃文亭，林采余，韓 睿，王玉波，陳恒屹，盧從華，李 力，何 勇△

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.呼吸科；2.胸外科，重慶400010）

吉非替尼是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的一種，目前被廣泛應(yīng)用于進(jìn)展或難治性非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的小分子靶向藥物，具有高選擇性和低毒性的優(yōu)點(diǎn)，在改善晚期NSCLC的近遠(yuǎn)期療效與生活質(zhì)量等方面具有令人鼓舞的前景。在臨床診療過程中，間質(zhì)性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）是吉非替尼少見但致命的不良反應(yīng)，全球范圍內(nèi)使用吉非替尼治療NSCLC并發(fā)ILD的總體發(fā)生率約為1%，死亡率高達(dá)30%[1-2]。但目前國(guó)內(nèi)外有基礎(chǔ)研究認(rèn)為吉非替尼對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠（或小鼠）肺纖維化有抑制作用，這一結(jié)論與臨床實(shí)踐完全相反，故明確吉非替尼對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的影響有利于探索臨床TKI相關(guān)性ILD的干預(yù)措施[3-5]。

TKI相關(guān)性ILD發(fā)病率較低，因此單純用吉非替尼灌胃動(dòng)物，成功誘導(dǎo)出肺纖維化概率非常低，動(dòng)物模型建立困難。有研究者證實(shí)即使單純大劑量吉非替尼（200mg／kg）灌胃亦不能引起小鼠明顯肺纖維化改變[3-4]。博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化動(dòng)物模型已較成熟，故采用博萊霉素致大鼠肺纖維化后，以吉非替尼干預(yù)博萊霉素所致肺纖維化，觀察其對(duì)纖維化的影響是高效、切實(shí)可行的辦法。本研究建立了博萊霉素致大鼠肺纖維化模型，探討不同劑量吉非替尼對(duì)纖維化的影響及劑量與效應(yīng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6周齡健康雄性SD大鼠75只（購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量200～210g。吉非替尼購(gòu)自英國(guó)Tocris Bioscience公司。Masson染色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒由武漢優(yōu)爾生公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組 將75只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分為對(duì)照組、博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組和高劑量吉非替尼聯(lián)用組，每組15只。將75只SD大鼠分別用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部去毛后乙醇消毒，縱行切開頸前皮膚，分離組織后暴露氣管。向氣管內(nèi)注入博萊霉素（5mg／kg，5g／L），對(duì)照組注入無菌生理鹽水200μL，注射后迅速將動(dòng)物直立，旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻。各組大鼠于氣管內(nèi)注射當(dāng)天開始連續(xù)灌胃21d，對(duì)照組與博萊霉素組予生理鹽水2mL灌胃，低、中、高劑量吉非替尼聯(lián)用組分別給予相同體積吉非替尼20、90、200mg／kg灌胃。氣管內(nèi)注射后第21天，殺鼠取肺。

1.2.2 肺組織病理學(xué)檢查 大鼠左肺以4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色及 Masson膠原染色，膠原染色嚴(yán)格按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。纖維化程度按Ashcroft等[6]的方法進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定 采用ELISA方法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s描述。Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，大鼠死亡率組間兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)第21天對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯充血、出血、炎癥浸潤(rùn)和纖維化等。博萊霉素組肺泡間隔明顯增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生。低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織病理改變與博萊霉素組表現(xiàn)相近。高劑量吉非替尼聯(lián)用組見組織破壞嚴(yán)重，纖維化明顯，肺泡間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞，上皮下肌成纖維細(xì)胞顯著增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部實(shí)變。組織切片經(jīng)Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色（圖1）。博萊霉素組Ashcroft評(píng)分較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）；低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評(píng)分與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高劑量吉非替尼聯(lián)用組評(píng)分較博萊霉素組顯著增高（P＜0.05）。5組大鼠肺纖維化病理評(píng)分，見表1。

圖1 各組大鼠第21天時(shí)肺組織HE染色及Masson染色（×200）

2.2 大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定 博萊霉素組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量較生理鹽水對(duì)照組高（P＜0.05）；低劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量吉非替尼聯(lián)用組及中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量明顯高于博萊霉素組（P＜0.05），見表1。

表1 Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較（±s）

表1 Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較（±s）

*：P＜0.05，與對(duì)照組比較；▲：P＜0.05，與博萊霉素組比較；△：P＜0.05，與中劑量吉非替尼聯(lián)用組比較。

組別 n Ashcroft評(píng)分（分）羥脯氨酸含量（μg／g）對(duì)照組15 0.32±0.14 126.14±19.83博萊霉素組 15 5.69±0.55* 630.93±27.64*低劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 5.72±0.41 616.47±40.97中劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 6.26±0.29 701.26±29.27▲高劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 8.27±0.83▲ 842.02±34.82▲△

2.3 大鼠一般情況比較 對(duì)照組大鼠體格健壯，體質(zhì)量增加明顯，進(jìn)食及飲水好，毛發(fā)有光澤，活動(dòng)靈敏，至21d均存活。博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠體質(zhì)量增加緩慢，精神狀態(tài)較差，毛發(fā)無光澤，活動(dòng)較少。高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠在給藥后第3天有8只出現(xiàn)腹瀉，至第5天13只大鼠呈稀水樣便（包括死亡的7只大鼠），21d時(shí)仍存活的4只大鼠較其他組大鼠體型明顯瘦弱、毛發(fā)晦暗、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠死亡情況[n（%）]

2.4 各組大鼠死亡率比較 各組大鼠7、14、21d死亡率見表2。

3 討 論

動(dòng)物模型是指用來進(jìn)行生物學(xué)、行為學(xué)、自發(fā)或誘發(fā)性病理過程研究，能夠表現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)方面類似人類或其他動(dòng)物種類的研究模型[7]。作為人類疾病的“復(fù)制品”，動(dòng)物模型應(yīng)具有再現(xiàn)性好、復(fù)制率高等特點(diǎn)。在臨床診療過程中，吉非替尼治療NSCLC并發(fā)相關(guān)ILD的發(fā)病率低，單純用吉非替尼灌胃動(dòng)物再現(xiàn)性差。本研究以博萊霉素建立ILD模型為基礎(chǔ)，予吉非替尼干預(yù)，可以觀察到吉非替尼對(duì)ILD動(dòng)物模型肺纖維化程度的影響。因此，該模型是研究TKI相關(guān)性ILD的一個(gè)可靠的模型。但該模型仍有一定的局限性。博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化按病理變化可分為4個(gè)階段，14～28d為肺間質(zhì)彌漫性纖維化期，故鼠肺纖維化實(shí)驗(yàn)通常需要觀察到14d后，甚至更長(zhǎng)[8]。在本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠呈稀水樣便，21d時(shí)較其他組大鼠體型明顯瘦弱，死亡率高達(dá)73.3%。吉非替尼常見的藥物不良反應(yīng)中消化道癥狀發(fā)生率高達(dá)84.8%，其中腹瀉占43.3%[9]。因此本研究認(rèn)為，在吉非替尼干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，消化道不良反應(yīng)是嚴(yán)重影響動(dòng)物存活率，增加非纖維化相關(guān)死亡的主要原因。這也是該模型有待解決及提高的方面。

吉非替尼可加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化，該動(dòng)物研究結(jié)果與既往大量臨床實(shí)踐中患者服用吉非替尼導(dǎo)致嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎的情況一致，這進(jìn)一步肯定了吉非替尼可誘導(dǎo)ILD而非抑制ILD[10]。之前有學(xué)者提出，200mg／kg吉非替尼聯(lián)用能抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的結(jié)論，探究其原因，可能與纖維化模型建立成功與否及動(dòng)物數(shù)量多少有關(guān)。本研究建立纖維化動(dòng)物模型采用的是大鼠氣管切開注射博萊霉素的方法，確保了博萊霉素通過氣道進(jìn)入肺從而致纖維化[11-12]。另一方面，各組動(dòng)物避免了死亡導(dǎo)致的剩余樣本量太少造成的誤差。

在博萊霉素致纖維化的情況下，高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠纖維化病理改變明顯加重（P＜0.05），Masson染色示肺組織中膠原沉積明顯增多，肺組織羥脯氨酸含量顯著升高（P＜0.05）。雖然中等劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評(píng)分較單純氣道內(nèi)注入博萊霉素組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但羥脯氨酸含量有明顯增加（P＜0.05）。而低劑量吉非替尼聯(lián)用組各項(xiàng)指標(biāo)與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上研究結(jié)果提示，吉非替尼劑量越大加重纖維化的程度越高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。吉非替尼在臨床應(yīng)用中，其推薦劑量為250mg／d，且不因年齡、體質(zhì)量以及基礎(chǔ)疾病等原因?qū)┝窟M(jìn)行調(diào)整。已有多項(xiàng)臨床研究表明，既往患有低蛋白血癥或肺間質(zhì)纖維化等疾病會(huì)增加ILD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，其原因是否與吉非替尼血藥濃度增加有關(guān)尚不清楚[13]。因此，筆者認(rèn)為對(duì)每天服用250mg推薦劑量吉非替尼并伴有低體質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)不良或ILD病史的患者，吉非替尼的使用需謹(jǐn)慎。

綜上所述，吉非替尼能加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化，且吉非替尼劑量越大，大鼠肺纖維化程度越高。吉非替尼干預(yù)博萊霉素所致大鼠肺纖維化是研究TKI-ILD的一個(gè)可靠的模型，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步探討其效應(yīng)及發(fā)病機(jī)制，探索臨床TKI相關(guān)性ILD的干預(yù)措施，乃至開發(fā)有效治療藥物。

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