黃文亭,林采余,韓 睿,王玉波,陳恒屹,盧從華,李 力,何 勇△
(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.呼吸科;2.胸外科,重慶400010)
吉非替尼是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的一種,目前被廣泛應(yīng)用于進(jìn)展或難治性非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的小分子靶向藥物,具有高選擇性和低毒性的優(yōu)點(diǎn),在改善晚期NSCLC的近遠(yuǎn)期療效與生活質(zhì)量等方面具有令人鼓舞的前景。在臨床診療過程中,間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是吉非替尼少見但致命的不良反應(yīng),全球范圍內(nèi)使用吉非替尼治療NSCLC并發(fā)ILD的總體發(fā)生率約為1%,死亡率高達(dá)30%[1-2]。但目前國(guó)內(nèi)外有基礎(chǔ)研究認(rèn)為吉非替尼對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠(或小鼠)肺纖維化有抑制作用,這一結(jié)論與臨床實(shí)踐完全相反,故明確吉非替尼對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的影響有利于探索臨床TKI相關(guān)性ILD的干預(yù)措施[3-5]。
TKI相關(guān)性ILD發(fā)病率較低,因此單純用吉非替尼灌胃動(dòng)物,成功誘導(dǎo)出肺纖維化概率非常低,動(dòng)物模型建立困難。有研究者證實(shí)即使單純大劑量吉非替尼(200mg/kg)灌胃亦不能引起小鼠明顯肺纖維化改變[3-4]。博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化動(dòng)物模型已較成熟,故采用博萊霉素致大鼠肺纖維化后,以吉非替尼干預(yù)博萊霉素所致肺纖維化,觀察其對(duì)纖維化的影響是高效、切實(shí)可行的辦法。本研究建立了博萊霉素致大鼠肺纖維化模型,探討不同劑量吉非替尼對(duì)纖維化的影響及劑量與效應(yīng)之間的關(guān)系。
1.1 材料 選取6周齡健康雄性SD大鼠75只(購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量200~210g。吉非替尼購(gòu)自英國(guó)Tocris Bioscience公司。Masson染色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒由武漢優(yōu)爾生公司生產(chǎn)。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組 將75只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,分為對(duì)照組、博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組和高劑量吉非替尼聯(lián)用組,每組15只。將75只SD大鼠分別用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,仰臥固定于鼠板上,頸部去毛后乙醇消毒,縱行切開頸前皮膚,分離組織后暴露氣管。向氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg,5g/L),對(duì)照組注入無菌生理鹽水200μL,注射后迅速將動(dòng)物直立,旋轉(zhuǎn),使藥液在肺內(nèi)分布均勻。各組大鼠于氣管內(nèi)注射當(dāng)天開始連續(xù)灌胃21d,對(duì)照組與博萊霉素組予生理鹽水2mL灌胃,低、中、高劑量吉非替尼聯(lián)用組分別給予相同體積吉非替尼20、90、200mg/kg灌胃。氣管內(nèi)注射后第21天,殺鼠取肺。
1.2.2 肺組織病理學(xué)檢查 大鼠左肺以4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋切片,組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色及 Masson膠原染色,膠原染色嚴(yán)格按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。纖維化程度按Ashcroft等[6]的方法進(jìn)行評(píng)分。
1.2.3 肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定 采用ELISA方法,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s描述。Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),大鼠死亡率組間兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 大鼠肺組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)第21天對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,無明顯充血、出血、炎癥浸潤(rùn)和纖維化等。博萊霉素組肺泡間隔明顯增寬,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生。低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織病理改變與博萊霉素組表現(xiàn)相近。高劑量吉非替尼聯(lián)用組見組織破壞嚴(yán)重,纖維化明顯,肺泡間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞,上皮下肌成纖維細(xì)胞顯著增多,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),局部實(shí)變。組織切片經(jīng)Masson染色后肌纖維呈紅色,膠原纖維呈藍(lán)色(圖1)。博萊霉素組Ashcroft評(píng)分較對(duì)照組顯著增高(P<0.05);低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評(píng)分與博萊霉素組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高劑量吉非替尼聯(lián)用組評(píng)分較博萊霉素組顯著增高(P<0.05)。5組大鼠肺纖維化病理評(píng)分,見表1。
圖1 各組大鼠第21天時(shí)肺組織HE染色及Masson染色(×200)
2.2 大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定 博萊霉素組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量較生理鹽水對(duì)照組高(P<0.05);低劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量與博萊霉素組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高劑量吉非替尼聯(lián)用組及中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量明顯高于博萊霉素組(P<0.05),見表1。
表1 Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較(±s)
表1 Ashcroft評(píng)分及羥脯氨酸含量比較(±s)
*:P<0.05,與對(duì)照組比較;▲:P<0.05,與博萊霉素組比較;△:P<0.05,與中劑量吉非替尼聯(lián)用組比較。
組別 n Ashcroft評(píng)分(分)羥脯氨酸含量(μg/g)對(duì)照組15 0.32±0.14 126.14±19.83博萊霉素組 15 5.69±0.55* 630.93±27.64*低劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 5.72±0.41 616.47±40.97中劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 6.26±0.29 701.26±29.27▲高劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 8.27±0.83▲ 842.02±34.82▲△
2.3 大鼠一般情況比較 對(duì)照組大鼠體格健壯,體質(zhì)量增加明顯,進(jìn)食及飲水好,毛發(fā)有光澤,活動(dòng)靈敏,至21d均存活。博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠體質(zhì)量增加緩慢,精神狀態(tài)較差,毛發(fā)無光澤,活動(dòng)較少。高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠在給藥后第3天有8只出現(xiàn)腹瀉,至第5天13只大鼠呈稀水樣便(包括死亡的7只大鼠),21d時(shí)仍存活的4只大鼠較其他組大鼠體型明顯瘦弱、毛發(fā)晦暗、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍。
表2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠死亡情況[n(%)]
2.4 各組大鼠死亡率比較 各組大鼠7、14、21d死亡率見表2。
動(dòng)物模型是指用來進(jìn)行生物學(xué)、行為學(xué)、自發(fā)或誘發(fā)性病理過程研究,能夠表現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)方面類似人類或其他動(dòng)物種類的研究模型[7]。作為人類疾病的“復(fù)制品”,動(dòng)物模型應(yīng)具有再現(xiàn)性好、復(fù)制率高等特點(diǎn)。在臨床診療過程中,吉非替尼治療NSCLC并發(fā)相關(guān)ILD的發(fā)病率低,單純用吉非替尼灌胃動(dòng)物再現(xiàn)性差。本研究以博萊霉素建立ILD模型為基礎(chǔ),予吉非替尼干預(yù),可以觀察到吉非替尼對(duì)ILD動(dòng)物模型肺纖維化程度的影響。因此,該模型是研究TKI相關(guān)性ILD的一個(gè)可靠的模型。但該模型仍有一定的局限性。博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化按病理變化可分為4個(gè)階段,14~28d為肺間質(zhì)彌漫性纖維化期,故鼠肺纖維化實(shí)驗(yàn)通常需要觀察到14d后,甚至更長(zhǎng)[8]。在本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠呈稀水樣便,21d時(shí)較其他組大鼠體型明顯瘦弱,死亡率高達(dá)73.3%。吉非替尼常見的藥物不良反應(yīng)中消化道癥狀發(fā)生率高達(dá)84.8%,其中腹瀉占43.3%[9]。因此本研究認(rèn)為,在吉非替尼干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,消化道不良反應(yīng)是嚴(yán)重影響動(dòng)物存活率,增加非纖維化相關(guān)死亡的主要原因。這也是該模型有待解決及提高的方面。
吉非替尼可加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化,該動(dòng)物研究結(jié)果與既往大量臨床實(shí)踐中患者服用吉非替尼導(dǎo)致嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎的情況一致,這進(jìn)一步肯定了吉非替尼可誘導(dǎo)ILD而非抑制ILD[10]。之前有學(xué)者提出,200mg/kg吉非替尼聯(lián)用能抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的結(jié)論,探究其原因,可能與纖維化模型建立成功與否及動(dòng)物數(shù)量多少有關(guān)。本研究建立纖維化動(dòng)物模型采用的是大鼠氣管切開注射博萊霉素的方法,確保了博萊霉素通過氣道進(jìn)入肺從而致纖維化[11-12]。另一方面,各組動(dòng)物避免了死亡導(dǎo)致的剩余樣本量太少造成的誤差。
在博萊霉素致纖維化的情況下,高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠纖維化病理改變明顯加重(P<0.05),Masson染色示肺組織中膠原沉積明顯增多,肺組織羥脯氨酸含量顯著升高(P<0.05)。雖然中等劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評(píng)分較單純氣道內(nèi)注入博萊霉素組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但羥脯氨酸含量有明顯增加(P<0.05)。而低劑量吉非替尼聯(lián)用組各項(xiàng)指標(biāo)與博萊霉素組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上研究結(jié)果提示,吉非替尼劑量越大加重纖維化的程度越高,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。吉非替尼在臨床應(yīng)用中,其推薦劑量為250mg/d,且不因年齡、體質(zhì)量以及基礎(chǔ)疾病等原因?qū)┝窟M(jìn)行調(diào)整。已有多項(xiàng)臨床研究表明,既往患有低蛋白血癥或肺間質(zhì)纖維化等疾病會(huì)增加ILD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),其原因是否與吉非替尼血藥濃度增加有關(guān)尚不清楚[13]。因此,筆者認(rèn)為對(duì)每天服用250mg推薦劑量吉非替尼并伴有低體質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)不良或ILD病史的患者,吉非替尼的使用需謹(jǐn)慎。
綜上所述,吉非替尼能加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化,且吉非替尼劑量越大,大鼠肺纖維化程度越高。吉非替尼干預(yù)博萊霉素所致大鼠肺纖維化是研究TKI-ILD的一個(gè)可靠的模型,在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步探討其效應(yīng)及發(fā)病機(jī)制,探索臨床TKI相關(guān)性ILD的干預(yù)措施,乃至開發(fā)有效治療藥物。
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