曹娜，葛力萁，程明月，張卓琦，王志榮

阿托伐他汀通過SIRT1/NADPH氧化酶對抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷作用*

曹娜，葛力萁，程明月，張卓琦，王志榮

目的：探討阿托伐他汀(atorvastatin, Atv)通過SIRT2沉默信息調(diào)節(jié)因子家族成員之一的SIRT1/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶對高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷的作用。

高糖；阿托伐他汀；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；SIRT1；NADPH氧化酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1000.)

當(dāng)今，動脈粥樣硬化及糖尿病成為威脅人類健康的兩大殺手，糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化的風(fēng)險增加。糖尿病患者體內(nèi)具有較高的氧化應(yīng)激水平，而氧化應(yīng)激參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞病理生理變化過程的各個環(huán)節(jié)，是動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)[1-3]。血糖升高作為糖尿病的特征表現(xiàn)，主要通過激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性增加，進(jìn)而引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加，對血管內(nèi)皮產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成[4]。目前已發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶（NOX）有5種同源家族體，分別為NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，而內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧主要來源于NOX4[5]。SIRT1是Sir2（silent information regulator2沉默信息調(diào)節(jié)因子）家族成員之一，在抵抗氧化應(yīng)激，延緩衰老，延長壽命等方面發(fā)揮重要作用。SIRT1的過表達(dá)能阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[6-7]。阿托伐他汀為第三代β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA) 還原酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于臨床，其除具有降脂作用外，還具有如抗炎、抗氧化、抗衰老、改善動脈粥樣硬化等作用[8,9]。但阿托伐他汀是否通過調(diào)節(jié)SIRTl表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、改善動脈粥樣硬化的作用尚少見報道。本研究旨在探討這一觀點的，為阿托伐他汀心血管保護(hù)作用提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料與方法

主要材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 (American type culture collection, ATCC)；阿托伐他汀原藥粉(Sigma，美國)；胎牛血清（Gibco，澳大利亞）；低糖型DMEM (Hyclone，美國)；甘露醇、D-葡萄糖、SIRT1抑制劑sirtinol、NOX4抑制劑apocynin(Sigma，美國)；BCA蛋白試劑盒、CCK-8試劑盒、活性氧檢測試劑盒(碧云天公司生物技術(shù)公司)；兔抗人SIRT1 單克隆抗體（Abcam，美國）；兔抗人NOX4多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔及馬抗鼠堿性過氧化物酶抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)與分組：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）細(xì)胞株在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的低糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%時，換不含血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于靜止生長期（G0/G1期）后分組：①正常組（葡萄糖5.6 mmol/L）；②滲透壓對照組（葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇27.7mmol/L）；③高糖組（葡萄糖33.3 mmol/L）；④高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀組；⑤高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀組；⑥高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀組；⑦高糖+SIRT1抑制劑組；⑧高糖+ NOX4抑制劑組。

細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力[10]：HUVECs由0.25%胰酶消化后在顯微鏡下計數(shù)，以每孔5×104接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，予以對應(yīng)處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光狀態(tài)下每孔加入CCK-8 10 μl，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后，錫箔紙包好96孔板，酶標(biāo)儀測定吸光度值（A450），實驗重復(fù)3次，用吸光度值表示細(xì)胞的增殖能力。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平[11]：細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，于培養(yǎng)基中加入熒光探針CM-H2DCFDA至終濃度為5 μmol/L，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，吸去培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的CM-H2DCFDA，之后用0.25%的胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗2遍，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，流式細(xì)胞儀檢測活性氧，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。上述步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測SIRT1和NOX4的表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白，BCA法[12]測定蛋白濃度后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉，用特異性抗SIRT1及NOX4抗體進(jìn)行免疫雜交檢測，β肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照，化學(xué)發(fā)光劑顯色，最后對目的條帶進(jìn)行掃描機(jī)密度分析。每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

阿托伐他汀對高糖環(huán)境下HUVECs增殖的影響：CCK-8結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖各組（高糖組、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀組、高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀組、高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀組）干預(yù)24 h后內(nèi)皮細(xì)胞的增值能力明顯下降（光密度值下降），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；且高糖各組間比較差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而滲透壓對照組24 h后內(nèi)皮細(xì)胞增值能力較正常組未見明顯改變。表1

表1 阿托伐他汀對高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

表1 阿托伐他汀對高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

注：與正常組比較*P＜0.05；與高糖組比較△P＜0.05；與高糖+0.1 μ mol /L阿托伐他汀組比較◆P＜0.05；與高糖+1.0 μ mol /L阿托伐他汀組比較▲P＜0.05

組別 光密度值（A450）正常組 1.291±0.049滲透壓對照組 1.228±0.069高糖組 0.782±0.071*高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀組 0.938±0.073*△高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀組 1.056±0.068*△◆高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀組 1.176±0.035*△◆▲

流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖各組（高糖組、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀組、高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀組）干預(yù)24 h后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；且高糖組與高糖+（0.1、1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀組之間、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀組與高糖+（1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀組之間比較，差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。滲透壓對照組24 h后內(nèi)皮細(xì)胞增值能力（內(nèi)活性氧水平）較正常組未見明顯改變。圖1

蛋白免疫印跡法檢測各高糖組細(xì)胞SIRT1、NOX4蛋白的表達(dá)：圖2示，高糖組較正常組SIRTl蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；滲透壓對照組與正常組相比SIRTl蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高糖+（0.1、1.0、10.0 μmol/L） 阿托伐他汀各組與高糖組相比SIRTl蛋白表達(dá)明顯增加差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。圖3示，高糖組較正常組NOX4蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），滲透壓對照組與正常組相比NOX4蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；高糖+（1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀各組與高糖組相比NOX4蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（n=3）

圖2 蛋白免疫印跡法檢測各高糖組細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)（n=3）

圖3 蛋白免疫印跡法檢測各高糖組細(xì)胞NOX4蛋白的表達(dá)（n=3）

sirtino1及apocynin對高糖誘導(dǎo)下HUVECs SIRT1及NOX4蛋白表達(dá)的影響：圖4示，高糖+SIRTI抑制劑組（sirtinol，50.0 μmol/L） 較高糖組SIRT1蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高糖+NOX4抑制劑組（apocynin，100.0 μmol/L）較高糖組SIRT1蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。圖5示，高糖+SIRTI抑制劑組（sirtinol，50.0 μmol/L） 較高糖組NOX4蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），高糖+NOX4抑制劑組（apocynin，100.0 μmol/L）較高糖組NOX4蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測sirtinol和apocynin組細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)（n=3）

圖5 蛋白免疫印跡法檢測sirtinol和apocynin組細(xì)胞NOX4蛋白的表達(dá)（n=3）

3 討論

動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）是由于脂肪、血栓、結(jié)締組織和碳酸鈣在血管（主要是動脈，但也包括靜脈）沉積所造成的一種對人體有害的狀態(tài)，嚴(yán)重威脅著人類的健康，了解動脈粥樣硬化形成和發(fā)展相關(guān)機(jī)制，尋找相應(yīng)的藥物治療靶點，對動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療無疑具有重要的意義。但截至目前為止，動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未明確，不過自Ross[13]于1999年提出“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”以來，越來越多的研究者認(rèn)識到，AS的形成與發(fā)展是一種慢性血管炎性反應(yīng)過程，且氧化應(yīng)激在其中扮演了重要的角色，參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞病理生理變化過程的各個環(huán)節(jié)，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)[1-3]。血糖升高作為糖尿病的特征表現(xiàn)，可以進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[14,15]。

血管內(nèi)皮中氧化應(yīng)激損傷主要源于線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶、NADPH氧化酶等多種途徑產(chǎn)生的活性氧，而NOX是內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧最主要的來源[16]。近幾年在對各種組織的研究中發(fā)現(xiàn)NOX有5種同源家族體，分別稱為NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)其中的NOX2和NOX4，且NOX4表達(dá)水平比NOX2高約20倍。進(jìn)一步的研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧主要來源于NOX4[5]。

他汀即β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA) 還原酶抑制劑的發(fā)展是冠心病治療史上的重要里程碑，除具有降脂作用外，還具有如抗炎、抗氧化、改善動脈粥樣硬化及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[8,9]。阿托伐他汀作為第三代他汀藥物，廣泛作用于臨床，大規(guī)模的臨床研究證實，阿托伐他汀能明顯降低心血管事件的發(fā)生率，其臨床獲益除降脂作用外，還與其抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎等脂外作用密切相關(guān)。Usharani 等[17]通過對口服阿托伐他汀的2型糖尿病患者進(jìn)行臨床研究，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以降低2型糖尿病患者丙二醛、ET-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。Roberto等[18]發(fā)現(xiàn)，在高膽固醇血癥的人群中，阿托伐他汀可以通過抑制PKC的激活，降低NADPH氧化酶的表達(dá)，對抗氧化應(yīng)激來實現(xiàn)其心血管保護(hù)作用。

本實驗中，一方面分別應(yīng)用低糖（5.7 mmol/L）、高糖（33.3 mmol/L）、甘露醇（27.7 mmol/L）作用于HUVEC，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測活性氧生成，Western-Blot法檢測NOX4的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常低糖組比較，高糖可以抑制HUVEC的增殖，升高NOX4的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，而甘露醇對照組卻沒有上述改變，說明高糖可以誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，其作用與高糖自身代謝有關(guān)，而與滲透壓無關(guān)。另一方面，先予以不同濃度阿托伐他?。?.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L）預(yù)處理1小時，再加入葡萄糖（27.7 mmol/L）共同作用23小時，再利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測活性氧生成，Western-Blot法檢測NOX4的表達(dá)。結(jié)果顯示，與高糖組比較，阿托伐他汀可以改善高糖對HUVECs增殖的抑制作用，降低NOX4表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，并呈濃度依賴性。提示阿托伐他汀對NADPH氧化酶表達(dá)的調(diào)控作用是其在高糖環(huán)境下抑制氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一。

SIRT1是Sir2（silent information regulator2沉默信息調(diào)節(jié)因子）家族成員之一，在轉(zhuǎn)錄沉寂、染色質(zhì)穩(wěn)定、雙鏈DNA斷裂損傷后生理修復(fù)、以及延長細(xì)胞周期中起重要作用，具有組蛋白去乙?；钚裕{(diào)節(jié)機(jī)體的壽命[19]。隨著年齡的增加，SIRTl在體內(nèi)的表達(dá)明顯下降，敲除SIRTl小鼠壽命明顯縮短。SIRTl的過表達(dá)能阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[6,7]?？傊?，SIRT1在抵抗氧化應(yīng)激，延緩衰老，延長壽命等方面發(fā)揮重要作用。他汀類藥物廣泛用于臨床，具有降脂，抗炎，抗氧化，抗動脈硬化，保護(hù)內(nèi)皮功能等作用。他汀類藥物是否通過SIRT1發(fā)揮作用成為近年來研究的熱點。Ota等[20]研究顯示他汀(阿托伐他汀、普伐他汀和匹伐他汀)可以抑制小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，通過激活一氧化氮合酶（eNOS）、升高SIRT1表達(dá)來實現(xiàn)。本研究通過阿托伐他汀作用于高糖損傷的HUVECs，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以升高高糖作用下HUVECs 的SIRT1蛋白的表達(dá)，實現(xiàn)其對抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷的作用。

SIRT1在抵抗氧化應(yīng)激，延緩衰老，延長壽命等方面發(fā)揮重要作用。NOX4是NOX一種，是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧最主要的來源。升高SIRT1的表達(dá)或降低NOX4的表達(dá)均可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，對抗氧化應(yīng)激，延緩衰老，但這兩者之間是否有關(guān)聯(lián)，目前尚未明確。本研究通過加用SIRT1及NOX4的抑制劑發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SIRT1的活性被抑制時，NOX4的表達(dá)增加，而當(dāng)NOX4活性被抑制時，SIRT1的表達(dá)未見明顯異常，提示SIRT1可能在NADPH氧化酶的上游發(fā)揮對抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過提高HUVECs的SIRT1蛋白的表達(dá)，實現(xiàn)其在高糖環(huán)境中抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性及下調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，從而對抗高糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。

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Atorvastatin Inhibits High Glucose-induced Oxidative Stress Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cells by SIRT1/NADPH Oxidase Pathway

CAO Na, GE Li-qi, CHENG Ming-yue, ZHANG Zhuo-qi, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou (221000), Jiangsu, China

WANG Zhi-rong, Email:xzzrw@163.com

Objective: To explore the effect of atorvastatin (Atv) on high glucose-induced oxidative stress injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by SIRT1/NADPH oxidase pathway with the possible mechanisms.Methods: HUVECs were cultured in low glucose medium and then divided into 6 experimental groups: ①Normal group,②Osmotic pressure control group, ③High glucose (HG) group, ④HG+ Atv (0.1, 1.0, 10.0) μmol/L group, ⑤HG+sirtinol (SIRT1 inhibitor) group, ⑥HG+apocynin (NOX4 inhibitor) group, and HUVECs were further cultured for 24 hours. The cell proliferation was examined by CCK-8 kit, ROS level was detected by fl ow cytometry method, protein expressions of SIRT1 and NOX4 were measured by Western blot analysis.Results:① Compared with Normal group, HG group had decreased HUVECs proliferation, Atv improved the HG inhibited proliferation in a does dependent manner.② HG group had the higher level of ROS, increased NOX4 protein expression and decreased SIRT1 protein expression.③ In HG condition, Atv up-regulated SIRT1 expression and downregulated ROS and NOX4 expressions in a does dependent manner.④In HG condition, sirtinol decreased SIRT1 expression, increased NOX4 expression, and apocynin decreased NOX4 expression, while it had no inf l uence on SIRT1 expression.Conclusion: Atorvastatin could resist HG-induced oxidative stress injury in HUVECs, which might be related to up-regulated SIRT1 expression, and SIRTI plays the role in NADPH oxidase at upstream.

High glucose; Atorvastatin; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress; SIRT1; NADPH oxidase

2014-02-20）

（編輯：梅平）

江蘇省興衛(wèi)工程醫(yī)學(xué)重點人才資助項目（項目編號：RC 2007089）

221000 江蘇省徐州市，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

曹娜 住院醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病防治的基礎(chǔ)與臨床研究 Email: nana2011two@163.com 通訊作者：王志榮 Email: xzzrw@163.com

R541

A

1000-3614（2014）12-1000-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.011

方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株低糖（5.6 mmol/L）培養(yǎng)貼壁后隨機(jī)分為正常組、滲透壓對照組、高糖組、高糖+（0.1、1.0、10.0 μ mol/L）阿托伐他汀組、高糖+SIRT1抑制劑（sirtinol）組及高糖+ NOX4抑制劑（apocynin）組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平， 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中SIRTl及NADPH氧化酶4（NOX4）的蛋白水平。

結(jié)果：①與正常組相比，高糖各組細(xì)胞增殖減低，阿托伐他汀組均可改善高糖對HUVECs增值的抑制作用，呈濃度依賴性。②高糖環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，NADPH氧化酶4的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，SIRTl的蛋白表達(dá)明顯降低。③阿托伐他汀可以上調(diào)高糖環(huán)境下SIRTl的表達(dá)，降低ROS、NADPH氧化酶4的表達(dá)，具有濃度依賴性。④高糖環(huán)境下，SIRTl抑制劑sirtinol可以降低SIRTl的表達(dá)，增加NADPH氧化酶4的表達(dá)，NADPH氧化酶4抑制劑apocynin可降低NADPH氧化酶4的表達(dá)，但對SIRT1的表達(dá)無明顯影響。

結(jié)論：阿托伐他汀可以對抗高糖誘導(dǎo)的HUVECs的氧化損傷，其可能的機(jī)制與升高內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)有關(guān)，且SIRT1在NADPH氧化酶的上游發(fā)揮對抗高糖誘導(dǎo)的氧化損傷作用。