南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽(yáng) 421001

miR-141在兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及意義

高順利 王立忠 劉海英 劉丹莉

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽(yáng) 421001

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為21～25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子。本研究旨在探討miR-141在兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中的表達(dá)及臨床意義。方法：收集B細(xì)胞ALL患兒35例為B細(xì)胞ALL組，以非血液病患兒15例為對(duì)照組，采集骨髓標(biāo)本，提取總RNA，采用real-time PCR檢測(cè)miR-141的表達(dá)，比較各組miR-141表達(dá)差異。結(jié)果：miR-141在B細(xì)胞ALL組中的表達(dá)低于對(duì)照組(P＜0.05)；miR-141在治療前的表達(dá)明顯低于治療第30天及第12周(P＜0.05)，治療第30天的表達(dá)低于治療第12周(P＜0.05)；≥10歲組miR-141的表達(dá)低于＜10歲組(P＜0.05)；低危組治療前miR-141表達(dá)高于中、高危組(P＜0.05)，而中危組高于高危組(P＜0.05)。結(jié)論：miR-141在兒童B細(xì)胞ALL中很可能存在抑癌作用，并是預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在靶點(diǎn)。

miR-141；急性淋巴細(xì)胞白血?。籅淋巴細(xì)胞；兒童；預(yù)后

白血病是造血系統(tǒng)的克隆性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康與生命。據(jù)報(bào)道，我國(guó)白血病的發(fā)病率約為2.76/10萬(wàn)，在男性及女性惡性腫瘤病死率中居第6位和第8位，在兒童及35歲以下成人中居第1位［1］。急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)是前體T、B淋巴細(xì)胞或成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)生克隆性異常增殖所致的白血病。ALL是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占兒童急性白血病的80%，且85%是B淋巴細(xì)胞ALL［2］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，化療、放療、生物調(diào)節(jié)劑治療及骨髓移植等方法已取得明顯進(jìn)步，但總體療效并不十分理想，20%～30%的兒童ALL出現(xiàn)復(fù)發(fā)，并且復(fù)發(fā)患兒的預(yù)后不佳［3］。在白血病的發(fā)生機(jī)制、早期診斷、治療及預(yù)后等方面仍有許多未知的問(wèn)題有待探討。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為21～25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子。miRNA在序列上具有高度保守性，表達(dá)上具有組織特異性和發(fā)育階段性。miRNA可通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合到靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)［4］。研究證實(shí)，多種miRNA在淋巴系惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用［5］。

miR-141是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抑制腫瘤功能的miRNA，其在骨肉瘤中表達(dá)下降，在骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-141可以抑制細(xì)胞增殖［6］。本研究擬通過(guò)檢測(cè)B細(xì)胞ALL患兒治療前、治療過(guò)程中及緩解后的骨髓細(xì)胞miR-141水平，期望探索出腫瘤預(yù)后評(píng)估及療效評(píng)價(jià)的新途徑，從而達(dá)到腫瘤個(gè)體化診療的目的。

1 材料和方法

1.1 病例資料

收集2011年6月—2013年9月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的新確診為B細(xì)胞ALL患兒35例(不包括成熟B-ALL)，并設(shè)為B細(xì)胞ALL組，其中男性16例，女性19例，中位年齡4.1(1.5～13.9)歲；根據(jù)全國(guó)小兒白血病會(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn)診斷［7］，依據(jù)中國(guó)兒童白血病協(xié)作組制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行危險(xiǎn)度評(píng)定及治療［8］，其中低危組15例，中危組11例，高危組9例(包括5例復(fù)發(fā))。以非血液病患兒(疝氣、四肢骨折)15例為對(duì)照組。

1.2 標(biāo)本采集

采集患兒治療前、治療第30天、治療第12周(有3例患兒死亡)骨髓3 mL。對(duì)照組患兒于入院時(shí)采集骨髓3 mL。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞的分離及總RNA的制備

骨髓肝素抗凝，加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心，分離單個(gè)核細(xì)胞。采用美國(guó)Invitrogen公司TRIzol提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，NanoDrop 1000檢測(cè)總RNA的濃度和純度，已制備的總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)洹?/p>

1.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR，RT-PCR)

取RNA 0.05 g，使用Taqman MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR：miR-141上游引物序列為5’-ACCCAGTGCGATTTGTCA-3’，下游引物序列為5’- ACTGTACTGGAAGATGGACC-3’；U6上游引物序列為5’- GCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，下游引物序列為5’- AAAATATGGAACGCTTCACG -3’，使用PCR Master Mix試劑盒及BioRad C1000 RT-PCR儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參，所測(cè)定的miR-141的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCT，CT=CTmiRNA-CTU6。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-141在B細(xì)胞ALL組與對(duì)照組中表達(dá)的比較

miR-141在B細(xì)胞ALL組中為(4.7±3.6)×10-4，在對(duì)照組中為(37.3±14.9)×10-4，miR-141在B細(xì)胞ALL組中的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

圖1 miR-141在B細(xì)胞ALL組與對(duì)照組中表達(dá)的比較Fig. 1 The expression of miR-141 in B cell ALL patients compared to the control group

2.2 miR-141表達(dá)與B細(xì)胞ALL患兒性別、年齡的關(guān)系

miR-141在男性患兒中的表達(dá)(5.2±4.6)×10-4，在女性患兒中的表達(dá)為(4.9±4.3)×10-4，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。將患兒以10歲為界限，分為兩組。miR-141在≥10歲組(8例)為(2.4±1.7)×10-4，＜10歲組(27例)為(5.8±4.3)×10-4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 miR-141在治療前B細(xì)胞ALL患兒各危險(xiǎn)度組中表達(dá)的比較

miR-141在低、中、高危組中的表達(dá)量分別為(8.9±2.1)×10-4、(4.8±1.3)×10-4和(1.8±0.8)×10-4，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 miR-141在治療前B細(xì)胞ALL患兒低中高危組中表達(dá)的比較Fig. 2 The expression of miR-141 in different risk groups of B cell ALL patients before treatment

2.4 miR-141在B細(xì)胞ALL患兒不同治療階段表達(dá)的比較

miR-141在治療前、治療第30天和第12周的表達(dá)量分別為(4.7±3.6)×10-4、(7.8±3.2)×10-4和(12.5±5.1)×10-4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。miR-141的表達(dá)隨著治療階段的進(jìn)展而增加。

3 討 論

研究證實(shí)，miR-141在多種腫瘤中表達(dá)下降并發(fā)揮抑瘤作用。miR-141在兒童腎臟腫瘤中表達(dá)下降［9］。miR-141因發(fā)生DNA甲基化在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)下降［10］。有研究證實(shí)，miR-141可作為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物［11］。miR-141可抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生上皮間質(zhì)樣變［12］。

本研究通過(guò)比較B細(xì)胞ALL組與對(duì)照組miR-141的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞ALL組miR-141的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，且隨著B(niǎo)細(xì)胞ALL組治療階段的深入，miR-141表達(dá)逐漸增加。以上結(jié)果證實(shí)，miR-141在兒童B細(xì)胞ALL中很可能發(fā)揮抑癌作用。

影響ALL預(yù)后的因素包括：初診年齡、潑尼松誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)、染色體與基因、免疫分型、外周血白細(xì)胞數(shù)、早期治療反應(yīng)等。在進(jìn)行治療前對(duì)患兒進(jìn)行分型再制定個(gè)體化的治療方案，是提高患兒生存期、降低復(fù)發(fā)率的重要保障［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-141的表達(dá)在≥10歲組低于＜10歲組，說(shuō)明miR-141的表達(dá)與年齡相關(guān)。因初診年齡≥10歲是預(yù)后不良的因素之一，檢測(cè)miR-141的表達(dá)可能具有評(píng)估兒童B細(xì)胞ALL預(yù)后的功能。B細(xì)胞ALL患兒治療前不同危險(xiǎn)度組比較，低危組miR-141表達(dá)量高于中、高危組，而miR-141在中危組與高危組中的表達(dá)也有差異，說(shuō)明miR-141的表達(dá)與B細(xì)胞ALL患兒危險(xiǎn)程度成正比。

隨著在兒童ALL中的miRNA研究日益增多，必將為白血病的診斷、預(yù)后判定和個(gè)性化治療提供新的方向。總之，在B細(xì)胞ALL患兒中，miR-141表達(dá)下降，并且與患兒的發(fā)病年齡、危險(xiǎn)度及治療階段相關(guān)，提示在B細(xì)胞ALL中，miR-141的表達(dá)水平可能是判定預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

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Expression and clinical significance of miR-141 in childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia

GAO Shun-li, WANG Li-zhong, LIU Hai-ying, LIU Dan-li (Department of Pediatrics, the First Af fi liated Hospital of Nanhua University, Hengyang Hunan 421001, China)

GAO Shun-li E-mail: gaosl123@163.com

Background and purpose:MicroRNAs are 19 to 25-nucleotide noncoding RNA molecules. The aim of this article was to investigate the expression and clinical signi fi cance of microRNA-141 in childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL).Methods:Bone marrow samples were collected from 35 children with B-cell ALL and 15 children with non hematologic disease. Total RNA was acquired from bone marrow. Real-time PCR was performed to detect the expression level of miR-141.Results:The relative expression level of miR-141 in B-cell ALL group was remarkably lower than those in the control (P＜0.05). The expression of miR-141 in newly diagnosed samples was lower than those in Day 30 and Week 12 samples respectively (P＜0.05). Besides, the expression of miR-141 in Day 30 samples was lower than those in week 12 samples (P＜0.05). The expression of miR-141 in children over 10 years old was signi fi cantly lower than those in children under 10 years old (P＜0.05). The expression of miR-141 in low-risk group was higher than those in mid-risk and high-risk group respectively (P＜0.05), and there was signi fi cant difference between mid-risk and high-risk groups (P＜0.05).Conclusion:MiR-141 is likely to have tumor suppressor effect and to be a potential prognostic biomarker in childhood B cell ALL.

MiR-141; Acute lymphoblastic leukemia; B cell; Children; Prognosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.002

R733.71

A

1007-3639(2014)03-0166-04

2014-01-24

2014-03-05）

湖南省教育廳課題(No：13C802)。

高順利 E-mail:gaosl123@163.com