（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

不同作用時程高壓氧治療對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的影響

韓光，李璐，李丹，趙平

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

目的探討不同作用時程高壓氧治療對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的影響。方法成年雄性SD大鼠28只，采用隨機數(shù)字表法，將其均分為4組：假手術組（S組）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄手術組（CCI組）、高壓氧治療5 d組（HBO 5 d組）、高壓氧治療10 d組（HBO 10 d組）。將HBO 5 d組和HBO 10 d組大鼠至于高壓氧艙，以0.012 5 MPa/min的速率向艙內(nèi)勻速加壓直至目標壓力并保持60 min。然后勻速減壓至正常大氣壓。從術后第1天開始高壓氧治療，連續(xù)5 d或10 d，1次/d。S組和CCI組單純放入氧艙100 min而不接受治療。于術前1 d，術后1，2，3，7，14，21，28 d測定機械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）。術后28 d取材觀察其脊髓的免疫組化指標，對一氧化氮合酶（NOS）表達進行比較。結果與S組比較，其他3組MWT降低，TWL縮短（P＜0.05）。與CCI組比較，HBO 5 d組和HBO 10 d組術后28 d MWT升高，TWL延長（P＜0.05），術后21 d 2組的MWT和TWL差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。術后21～28 d，HBO 5 d組和HBO 10 d組MWT和TWL差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CCI后，NOS的表達明顯增加，與CCI組比較，HBO5 d組與HBO 10 d組增加更顯著（P＜0.05）。而HBO 5 d與HBO 10 d組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論不同作用時程高壓氧治療均可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛，并且作用時間越長可能鎮(zhèn)痛效果越持久。

高壓氧；神經(jīng)病理性疼痛；鎮(zhèn)痛效果

高壓氧具有增強抗氧化酶活性、加速清除自由基、提高血氧含量、改善微循環(huán)的作用，對損傷的神經(jīng)組織有修復和保護作用，在臨床上已廣泛應用。本課題組前期研究表明，高壓氧治療可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛［1，2］，并且其鎮(zhèn)痛效果與高壓氧壓力無關［3］，而與高壓氧作用時間是否有關尚不清楚。本研究擬評價不同作用時間高壓氧治療對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響。

1 材料與方法

成年雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量350～400 g，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供，采用隨機數(shù)字表法，將其均分為4組：假手術組（S組）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄手術組（CCI組）、高壓氧治療5 d組（HBO 5 d組）、高壓氧治療10 d組（HBO10 d組）。

1.1 CCI模型的制備

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，采用Bennett等［4］的模型行坐骨神經(jīng)慢性縮窄術：取右后肢后外側切口，在股骨后找到坐骨神經(jīng)主干，分離右側坐骨神經(jīng)，用4-0絲線分別相距約1 mm的間距做松弛結扎，直到神經(jīng)外膜稍稍受壓為止。結扎標準為：使坐骨神經(jīng)支配區(qū)域的肌肉出現(xiàn)暫短的收縮。然后分層縫合皮膚，待動物清醒后歸籠飼養(yǎng)觀察。假手術組大鼠則僅暴露坐骨神經(jīng)而不結扎。

1.2 實驗鼠的高壓氧處理

HBO 5 d組從術后第1天開始連續(xù)5 d高壓氧治療，HBO 10 d組從術后第1天開始連續(xù)10 d高壓氧治療。預先將鈉石灰置于高壓氧艙底以減少水蒸氣和CO2的蓄積，進艙后，先用純氧洗艙10 min，使艙內(nèi)O2濃度＞90%，加壓速率為0.012 5 MPa/min，加壓至0.25 MPa，在高壓氧狀態(tài)下停留60 min，其間用純氧通氣10 min。停留畢，以30 min勻速減至常壓。S組和CCI組單純放入氧艙100 min而不接受治療，模擬除壓力、氧濃度外的類同實驗組的其他處理過程和環(huán)境條件。

1.3 取材

用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈，灌注0.9%的生理鹽水至流出液不含紅色，然后灌注含4%多聚甲醛的（0.1 mol/L）磷酸鹽緩沖液（pH7.4）固定，取動物L4～L6腰段脊髓浸泡在4%多聚甲醛中待用。

1.4 觀察指標

行為學檢測于術前1 d（-1 d）及術后1，2，3，7，14，21，28 d上午9時～11時測定。除S組于手術當日行假手術外，其余3組均行坐骨神經(jīng)結扎（CCI）。HBO 5 d組和HBO 10 d組在術后第1天開始分別連續(xù)高壓氧治療5 d和10 d。并在第28天處死留取標本。（1）自發(fā)性痛行為檢測：觀察鼠步態(tài)、右后肢體位、有無自噬行為及后肢持重等情況；（2）測定機械性縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）：利用Von Frey纖維測量，參照Dixon［5］的方法。將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機玻璃罩。先讓大鼠適應環(huán)境，用von Frey纖維垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成S形，持續(xù)6～8 s，觀察是否出現(xiàn)縮足反應。纖維絲壓力依次為0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g，每次間隔30 s；（3）熱輻射法測定大鼠熱刺激爪退縮閾值（thermal withdrawal latency，TWL）：采用光熱測痛儀，利用聚光燈產(chǎn)生一定強度的光，通過產(chǎn)生熱量致痛。將光輻射焦點對準大鼠足跖底中部，以大鼠抬腿或逃走的潛伏期作為熱刺激爪退縮閾值。連續(xù)測3次，間隔5 min，取其平均值。為防止熱輻射損傷，光照最長時限定為20 s。

新鮮標本用4%多聚甲醛固定4 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋制作石蠟切片，厚度40 μm。切片經(jīng)0.01 mol/L的PBS沖洗3次后，依次加入3%H2O2，30%封閉血清封閉10 min后加入抗一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抗體（1∶200），4℃孵育48 h。PBS沖洗3次后，滴加生物素標記的第二抗體（羊抗兔IgG）。37℃孵育1.5 h后PBS沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育1.5 h后PBS沖洗，DAB顯色，貼片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察，棕色染色的為陽性細胞。陰性對照實驗中，用PBS代替一抗或二抗，未見NOS樣染色的神經(jīng)元。每個脊髓切片時隔5張取1張，在Olympus光學顯微鏡下選取恒定位置脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)佑嫈?shù)NOS陽性神經(jīng)元。

顯微照相及圖像分析應用U-MCB Olympus圖像采集系統(tǒng)，METAMORPH/COOL SNAP+X/AX70顯微（熒光）圖像分析系統(tǒng)（VIC/ROPER OLYMPUS）US/JP，對切片進行分析處理，每只動物取4張切片，測定陽性細胞數(shù)值，放大400倍照相。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般行為學觀察

各組大鼠試驗期間未出現(xiàn)死亡，出現(xiàn)典型的觸誘發(fā)痛閾值及熱輻射閾值降低。HBO 5 d組有1只大鼠分離坐骨神經(jīng)時機械損傷過重而被排除實驗。CCI模型成功制備的標準：術后3 d即出現(xiàn)結扎側患足足趾并攏背屈、外翻、成防御姿勢，不負重，

患足行走無力，運動時明顯跛行，膝關節(jié)著地，右足掌懸空或拖行；術后14 d左右患肢出現(xiàn)明顯肌肉萎縮，患肢足底輕觸刺激時，大鼠常將其迅速抬起并放入口中舔吮，在空中不停地甩動損傷側后肢。假手術組未見上述現(xiàn)象。神經(jīng)病理性疼痛大鼠出現(xiàn)足趾并攏、足外翻、舔足、甩足等行為學改變。

2.2 各組MWT及TWL比較

4組MWT和TWL基礎值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與S組比較，其余3組MWT降低，TWL縮短（P＜0.05）；HBO 5 d組和HBO 10 d組各時點MWT和TWL均較CCI組延長（P＜0.05）。術后21 d內(nèi)HBO 5 d與HBO 10 d的MWT和TWL差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。術后28 d時，HBO 5 d組和HBO 10 d組MWT和TWL差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1，表2。

表1 各組大鼠機械性縮足反射閾值（MWT）的測量結果Tab.1 Mechanical withdraw threshold of rats in each group

表1 各組大鼠機械性縮足反射閾值（MWT）的測量結果Tab.1 Mechanical withdraw threshold of rats in each group

1）P＜0.05 vs group S；2）P＜0.05 vs group CCI.

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表2 各組大鼠熱縮足反射潛伏期（TWL）的測量結果（Tab.2 Thermal withdrawal latency of rats in each group（

表2 各組大鼠熱縮足反射潛伏期（TWL）的測量結果（Tab.2 Thermal withdrawal latency of rats in each group（

1）P＜0.05 vs group S；2）P＜0.05 vs group CCI.

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2.3 各組免疫組化結果比較

大體標本各組腦和脊髓標本未見異常。坐骨神經(jīng)結扎后3 d即見結扎側坐骨神經(jīng)腫脹增粗。假手術側坐骨神經(jīng)干無腫脹、出血或粘連，容易暴露及游離。

S組、CCI組、HBO 5 d組、HBO 10 d組NOS陽性細胞數(shù)分別為（9.68±2.31）×10-4、（47.53±3.23）×10-4、（35.86±3.57）×10-4、（32.42±2.89）×10-4，與S組比較，CCI組、HBO 5 d組、HBO 10 d組NOS在脊髓膠質(zhì)細胞數(shù)目顯著增加（P＜0.05），與CCI組比較，HBO 5 d組和HBO 10 d組NOS細胞顯著增加（P＜0.05），HBO 5 d組的NOS細胞較HBO 10 d組稍多，但2組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組脊髓膠質(zhì)細胞NOS陽性細胞免疫組化×400Fig.1 Distribution of NOS positive cells in rats′spinal cord×400

3 討論

近幾年來高壓氧治療神經(jīng)病理性疼痛已經(jīng)在國內(nèi)外期刊陸續(xù)被報道［1，2，6］。研究合適的壓力、合適的作用時間等最佳治療方案是這個問題的焦點之一。一些關于高壓氧時機的研究側重在高壓氧

的作用時機，即早期或晚期。認為從HBO對NOS的作用看，不管是缺血早期還是晚期，應用HBO治療都是有益的，但早期相對效果更好［7］?，F(xiàn)在公認高壓氧治療的最佳時間窗是在組織損傷的6 h內(nèi)［8］。但也有學者認為對于患者來說，在受傷后的6 h之內(nèi)即可接受高壓氧的治療幾乎是不可能完成的事情。他們認為高壓氧可以改善血液循環(huán)，減輕局部水腫等，對受傷的神經(jīng)元起到保護作用并防止進一步損傷［9，10］。因而損傷晚期應用高壓氧亦有效。

本研究結果顯示，不同高壓氧作用時程大鼠MWT均升高，TWL均延長，但是，在術后21 d內(nèi)，不同作用時程的高壓氧治療對痛閾等的影響無顯著差異；28 d時表現(xiàn)為鎮(zhèn)痛的效果延長，提示高壓氧可以減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛，且作用時程長可能延長其鎮(zhèn)痛效果。其原因可能是HBO通過增強組織有氧氧化產(chǎn)生大量高能磷酸化合物ATP，使細胞膜上的Na+、K+-ATP酶及鈣泵活性恢復，糾正了Ca2+超載，進而抑制了Ca2+依賴的NOS陽性細胞過分產(chǎn)生NO，達到鎮(zhèn)痛目的的同時還保護了脊髓的結構［11，12］。作用時程長，Ca2+超載情況更容易受到抑制，鎮(zhèn)痛效果就更長久。另外，高壓氧可減輕或消退神經(jīng)組織水腫、促進髓鞘再生、促進周圍神經(jīng)再生及激活的內(nèi)源性阿片肽也可能是原因之一［13，14］。但不同作用時程對鎮(zhèn)痛效果影響的原因尚不清楚，其具體機制有待本課題組進一步研究。

本實驗不足之處在于時程設置的長短方面。更長的作用時程是否同樣能有效提高效果，更長時間的高壓氧是否會氧中毒［15］，時程的安全范圍與鎮(zhèn)痛效果的完美結合點在哪等等問題還有待于進一步探討研究。雖然高壓氧潛在的毒性機制不明確可能制約其應用，但高壓氧在神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛方面的發(fā)展前景還是相當廣大的。

綜上所述，高壓氧治療可減輕大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，并且更長的作用時程可以相對延長其鎮(zhèn)痛效果。

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（編輯 武玉欣）

EffectofDifferent Hyperbaric Oxygen Exposure Time on Antinociceptive Response in Rat Neuropathic Pain Model

HAN Guang，LILu，LIDan，ZHAO Ping
（DepartmentofAnesthesiology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effect of antinociceptive response induced by different hyperbaric oxygen（HBO）exposure in an animal model of neuropathic pain.MethodsA total of 28 healthy male SD rats were randomly divided into four groups（n=7）：Group S（sham group），Group CCI（chronic constrictive injury group），Group HBO 5 d（HBO duration for five days group）and Group HBO 10 d（HBO duration for ten days group）.Group CCI，group HBO 5 d and group HBO 10 d received the surgery of CCI，while group S only received sham operation.Rats of group HBO 5 d and group HBO 10 d received HBOone time perday for5 days or10 days since the 1stday aftersurgery.Afterputting rats inside the HBO chamber，the pressure was increased at a rate of 0.012 5 MPa/min to the desired pressure and maintained for 60 minutes.Rats of group S and group CCI were simply placed inside the chamber for approximately 100 min，but without HBO.The mechanical withdrawal threshold（MWT）and thermal withdrawal latency（TWL）of all animals were measured at 1 d before CCI，1 d，2 d，3 d，7 d，14 d，21 d and 28 d after CCI respectively.ResultsCompared with group S，MWT was significantly decreased and TWL was significantly shortened in other groups.Compared with group CCI，MWT was elevated and TWL was prolonged significantly in group HBO 5 d and HBO 10 d（P＜0.05）.Compared with group HBO 5 d，MWT was elevated and TWL was prolonged in group HBO 10 d（P＜0.05）after postoperative 21 days.There was no significant difference in alteration of the antinociceptive response effect between groups HBO 5 d and HBO 10 d within postoperative 21 days（P＞0.05）.After CCI treatment，the NOS expression was increased.NOS expression was significantly decreased in the HBO 5 d and HBO10 d groups.There was no significant difference between HBO 5 d and HBO 10 d.ConclusionDifferentHBOdurationsinfluenced antinociceptive effects on CCIrats with neuropathic pain.

hyperbaric oxygen；neuropathic pain；antinociception

R614

A

0258-4646（2014）02-0159-04

韓光（1978-），女，講師，碩士.

趙平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2013-10-20

網(wǎng)絡出版時間：