張振勇，曹秋婷，吳榮

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽(yáng)110022；2.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116021）

放射性肺損傷中核因子κB和細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)及意義

張振勇1，曹秋婷2，吳榮1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽(yáng)110022；2.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116021）

目的探討放射性肺損傷中核因子κB（NF-κB）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達(dá)情況及其在放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)對(duì)象為Wistar大鼠，照射組接受X線照射（分為15 Gy照射組和20 Gy照射組），未照射組不接受照射。照射后飼養(yǎng)28 d，通過(guò)免疫組化法測(cè)定NF-κB和ICAM-1的表達(dá)，免疫組化染色利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果NF-κB在未照射組少量表達(dá)，在15 Gy照射組和20 Gy照射組中表達(dá)均增強(qiáng)，與未照射組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），且2個(gè)照射組比較NF-κB表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。未照射組ICAM-1幾乎不表達(dá)，15 Gy照射組和20 Gy照射組與未照射組相比ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），但2個(gè)照射組比較ICAM-1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論NF-κB和ICAM-1是導(dǎo)致急性放射性肺損傷的重要因素。通過(guò)減少NF-κB的活化調(diào)控ICAM-1的表達(dá)，可能減少放射性肺損傷，這為放射性肺損傷的預(yù)防和治療可能提供新的治療靶點(diǎn)。

核因子κB；細(xì)胞間黏附分子1；放射性肺損傷

放射治療目前仍是治療腫瘤的主要手段之一，應(yīng)用放療治療胸部腫瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等時(shí)，正常的肺組織均會(huì)或多或少的受到一定劑量的照射而造成一定程度的放射性肺損傷，通常為降低這種放射性肺損傷的發(fā)生率，腫瘤靶區(qū)劑量會(huì)受到一定的影響。放射性肺損傷主要有放射性肺纖維化和放射性肺炎兩種。但由于發(fā)生機(jī)制不明和治療方法有限，放射性肺損傷成為胸部放療的主要限制性因素，因此放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制的研究及治療靶點(diǎn)的探索具有重要意義。

研究顯示，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種控制編碼細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子、疾病和

健康狀態(tài)下一些基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明NF-κB極易被輻射激活，同時(shí)也顯示著它與放射性損傷有著密切的關(guān)系［1］。細(xì)胞間黏附因子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是近年來(lái)在炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞與細(xì)胞之間扮演中介角色的細(xì)胞因子，在放射性肺損傷過(guò)程中也擔(dān)任非常重要的角色。本研究以大鼠接受不同劑量照射建立動(dòng)物模型，觀察NF-κB與ICAM-1在放射性肺損傷過(guò)程中的表達(dá)，為揭示放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)制和治療措施提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性Wistar大鼠（SPF級(jí)）40只（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)），月齡為3個(gè)月，體質(zhì)量180～220 g。所有大鼠均飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心P3實(shí)驗(yàn)室屏障系統(tǒng)中，按照中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)、管理。

主要儀器、設(shè)備及試劑：彩色超聲診斷儀EUB-8500（日本日立公司），醫(yī)用直線加速器（德國(guó)西門子公司），光學(xué)顯微鏡BX50（日本OLYMPUS公司），病理圖像分析儀HPIAS-100（西安華海電子有限公司），生物組織石蠟包埋機(jī)TEC-2800型（意大利郝思琳），石蠟切片機(jī)RY-2235（德國(guó)LEICA公司），二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），NF-κB多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruze公司），ICAM-1兔IgG多克隆抗體（即用型，博士德生物工程有限公司），免疫組化染色試劑盒（即用型SABC，博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組干預(yù)：將Wistar大鼠隨機(jī)分成未照射組（10只）、15 Gy照射組（15只）和20 Gy照射組（15只）。照射組照射前用10%水合氯醛將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉（劑量0.3 mL/100 mg），在鼠板上仰臥固定，醫(yī)用直線加速器調(diào)至10 MeV X線進(jìn)行右全肺照射，單野，射野范圍2 cm×2 cm，源皮距為100 cm，左胸及身體其余部位裝置鉛擋。照射后大鼠自然蘇醒。未照射組僅麻醉。

1.2.2 標(biāo)本的制備：大鼠照射后飼養(yǎng)28 d，最后存活的大鼠數(shù)量為未照射組10只、15 Gy照射組13只、20 Gy照射組12只，將大鼠斷頸法處死，取右肺葉組織以甲醛固定，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?8 h后將固定的組織放入70%乙醇溶液中。將保存在乙醇中的組織取出，取約10 g大小組織放入包埋盒中。在自動(dòng)脫水機(jī)中脫水，完全脫水后經(jīng)石蠟透明。然后放入制模鐵片上，用石蠟機(jī)完全包埋、填充，靜置于室溫1 h，存貯于-20℃冰箱2 h后置于切片機(jī)上輕輕切片，將石蠟薄片浸于水中完全舒展后，置于烤箱中干燥1～2 h。

1.2.3 免疫組化染色：將切片脫蠟后用蒸餾水洗2 min再用PBS液洗3次，3%H2O2室溫浸泡10 min后用PBS液洗3次，高壓高溫抗原修復(fù)10 min冷卻，再用10%血清封閉30 min。待將血清甩掉，加第一抗體（1∶200稀釋）1滴，4℃放置過(guò)夜。PBS液洗3次后加第二抗體1滴，室溫放置30 min。繼續(xù)用PBS液洗3次。加SABC 1滴，放置室溫30 min。甩掉SABC后用PBS液洗3次。加DAB 1滴后置于顯微鏡下，見(jiàn)染色后繼續(xù)用PBS液洗后用蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)后用梯度乙醇及二甲苯脫水，樹(shù)膠封片。

1.2.4 光鏡下觀察結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)/核染成棕黃色或黃色為免疫組化陽(yáng)性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物選取染色好的切片1張，隨機(jī)在每張切片上選取視野7個(gè)，采用圖像分析儀分別測(cè)定NF-κB及ICAM-1的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NF-κB的表達(dá)情況

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，未照射組中細(xì)胞質(zhì)/核染成黃色或棕黃色的細(xì)胞較少，提示NF-κB有少量表達(dá)；15 Gy照射組與20 Gy照射組可見(jiàn)大量細(xì)胞質(zhì)/核染成棕黃色，提示NF-κB表達(dá)均增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

2.2 NF-κB表達(dá)的定量測(cè)定

未照射組、15 Gy照射組、20 Gy照射組NF-κB光密度值分別為0.085±0.004、0.191±0.031、0.235± 0.009。15 Gy照射組、20 Gy照射組與未照射組相比，NF-κB光密度值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），并且2個(gè)照射組相比NF-κB光密度值也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

2.3 ICAM-1的表達(dá)情況

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，未照射組少有細(xì)胞質(zhì)/核黃染，提示ICAM-1在正常肺泡組織中幾乎不表達(dá)。

15 Gy照射組和20 Gy照射組可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)/核染成棕黃色，提示ICAM-1表達(dá)均增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.4 ICAM-1表達(dá)的定量測(cè)定

未照射組、15 Gy照射組、20 Gy照射組ICAM-1光密度值分別為0.085±0.004、0.230±0.019、0.234± 0.017。15 Gy照射組、20 Gy照射組與未照射組相比，ICAM-1光密度值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但2個(gè)照射組相比ICAM-1光密度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠NF?κB的表達(dá)×40Fig.1 NF?κB expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

圖2 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠ICAM?1的表達(dá)×40Fig.2 ICAM?1 expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

3 討論

放射性肺損傷分為早期損傷和晚期損傷。美國(guó)放射腫瘤治療協(xié)作組將發(fā)生在放療開(kāi)始后90 d內(nèi)的放射損傷稱為急性放射損傷，超過(guò)90 d發(fā)生的稱為晚期放射損傷。早期放射性肺損傷主要為放射性肺炎，是一種由免疫介導(dǎo)的以淋巴細(xì)胞性肺泡炎為主的局部放射反應(yīng)。晚期放射性肺損傷主要為放射性纖維化，是因靶細(xì)胞損傷后釋放多種細(xì)胞因子，啟動(dòng)成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖，導(dǎo)致膠原蛋白大量合成，最終使大量膠原沉積在肺間質(zhì)［2］。研究顯示，大鼠肺組織接受15～20 Gy劑量照射，8～12周后會(huì)產(chǎn)生放射性損傷的系列改變［3］，這些變化可能與受照體積、受照部位、放射劑量、放療時(shí)間等都有關(guān)。放射肺損傷的機(jī)制研究開(kāi)始于上世紀(jì)50年代，主要學(xué)說(shuō)有肺泡上皮損傷、肺泡巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肺血管平滑肌損傷、淋巴管受累、免疫反應(yīng)、巨細(xì)胞病毒參與等［4，5］。目前認(rèn)為放射性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，多種細(xì)胞因子在放射性肺炎和肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控作用。

近幾年發(fā)現(xiàn)NF-κB是一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，生物學(xué)活性廣泛，極易被激活，如腫瘤壞死因子α、免疫球蛋白G、射線、毒素等，激活后的NF-κB又可促進(jìn)多種炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子等轉(zhuǎn)錄，并參與多種細(xì)胞因子、趨化因子和促纖維因子的合成，以及細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)、成纖維細(xì)胞的分化和細(xì)胞增殖過(guò)程［6］，從而在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要角色。NF-κB有5種不同的二聚體形式，不同的二聚體具有不同的結(jié)合序列，從而具有不同的功能特性［7］。在絕大多數(shù)靜止期的細(xì)胞中，NF-κB以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，并可被許多刺激物所激活?，F(xiàn)今越來(lái)越多的研究證據(jù)證明輻射可以激活NF-κB，這可能與放射性肺損傷關(guān)系密切，也可能刺激前炎性因子在放射性肺損傷過(guò)程中產(chǎn)生作用。Sherman等［8］、Brach等［9］研究先后顯示了輻射可以激活TNF基因，進(jìn)而在NF-κB的激活過(guò)程中起重要的作用。本研究中也顯示，大鼠肺組織分別接受15 Gy、20 Gy放射線照射后，肺組織中的NF-κB被激活，較未照射組表達(dá)增多，表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Haase等［10］研究還顯示照射劑量增大后的鼠肺中NF-κB的表達(dá)增高達(dá)6個(gè)月以上，因此認(rèn)為這可能與后期的慢性炎癥和間質(zhì)細(xì)胞纖維化有關(guān)。

對(duì)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制目前公認(rèn)為：（1）早期各種外源性或內(nèi)源性刺激引起大量炎性細(xì)胞聚集后滲出到肺泡腔、肺間質(zhì)中，從而參與了肺損傷［11］；（2）其后炎性細(xì)胞和肺細(xì)胞分泌大量致纖維化因子，導(dǎo)致纖維組織增生，肺泡結(jié)構(gòu)毀損。在這個(gè)過(guò)程中，不同細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用尤其重要，而黏附分子在它們中扮演著橋梁的角色［12］。黏附分子可以使細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與基質(zhì)之間更易于接觸和結(jié)合，繼而參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)等一系列重要病理生理過(guò)程。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，主要存在于肺組織的肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮上，肺間質(zhì)纖維化時(shí)，在炎性介質(zhì)作用下，通過(guò)CD11/CD18-ICAM-1途徑，可黏附白細(xì)胞使CD11/CD18表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)亦上調(diào)［13］，故而能加重肺損傷。輻射可誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1，趨化白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果提示，正常大鼠肺組織中ICAM-1表達(dá)呈陰性或弱陽(yáng)性，接受照射后ICAM-1在肺組織中表達(dá)增強(qiáng)，但與劑量關(guān)系不大，即低劑量照射組與高劑量照射組之間光密度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但這仍表明ICAM-1與肺損傷的炎性反應(yīng)密切相關(guān)。目前，黏附因子參與肺纖維化的作用機(jī)制尚不明確。據(jù)免疫組化測(cè)定ICAM-1表達(dá)結(jié)果推測(cè)，ICAM-1可能參與肺間質(zhì)纖維化形成。有研究利用博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型［14］，并從中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞的累積水平與肺組織纖維化程度相關(guān)，而L-選擇素、ICAM-1可介導(dǎo)白細(xì)胞聚集，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［15］。所以說(shuō)ICAM-1在肺纖維化發(fā)展中的扮演著一個(gè)復(fù)雜的角色。

也有研究提示了某些組織中NF-κB活性的改變與ICAM-1表達(dá)相關(guān)［16］，在基礎(chǔ)狀態(tài)下少量NF-κB被刺激后激活，而ICAM-1的表達(dá)變化又與之同步。所以我們猜測(cè)，在放射性肺損傷中NF-κB很可能在基因轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)ICAM-1的表達(dá)起著調(diào)控作用，從而影響其后的一系列炎癥發(fā)展過(guò)程。雖然NF-κB對(duì)ICAM-1表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，但我們推測(cè)通過(guò)NF-κB抑制劑減少NF-κB的活化后，既可以減少NF-κB調(diào)控下的相關(guān)炎性反應(yīng)，也可以調(diào)控ICAM-1的表達(dá)，以減輕肺泡炎性反應(yīng)，進(jìn)而減少肺組織損傷。這將是我們研究的新方向，給與此相關(guān)的疾病提供了一個(gè)新的治療靶位。

［1］Suzuki Y，Ruiz-Ortega M，Lorenzo O.Inflammation and angiotensinⅡ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2003，35（6）：881-900.

［2］Tsoutsou PG，Koukourakis MI.Radiation pneumonitis and fibrosis：mechanisms underlying its pathogenesis and implications for future research［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006，66（5）：1281-1293.

［3］Seppenwoolde Y，Lebesque JV.Partial irradiation of the lung［J］. Semin Radiat Oncol，2001，11（3）：247-258.

［4］Movsas B，Raffin TA，Epstein AH，et al.Pulmonary radiation injury［J］.Chest，1997，111（4）：1061-1076.

［5］Rübe CE，Uthe D，Schmid KW，et al.Dose-dependent induction of transforming growth factor beta（TGF-beta）in the lung tissue of fibrosis-prone mice after thoracic irradiation［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008，47（4）：1033-1042.

［6］Yang CR，Wilson-Van Patten C，Planchon SM，et al.Coordinate modulation of Sp1，NF-kappa B，and p53 in confluent human malignant melanoma cells after ionizing radiation［J］.FASEB J，2000，14（2）：379-390.

［7］Brasier AR.The NF-kappaB regulatory network［J］.Cardiovasc Toxicol，2006，6（2）：111-130.

［8］Sherman ML，Datta R，Hallahan DE，et al.Regulation of tumor necrosis factor gene expression by ionizing radiation in human myeloid leukemia cells and peripheral blood monocytes［J］.J Clin Invest，2010，87（5）：1794-1797.

［9］Brach MA，Hass R，Sherman ML，et al.Ionizing radiation induces expression and binding activity of the nuclear factor kappa B［J］.J Clin Invest，1991，88（2）：691-695.

［10］Haase MG，Klawitter A，Geyer P，et al.Sustained elevation of NF-κB DNA binding activity in radiation-induced lung damage in rats［J］. Int J Radiat Biol，2008，79（11）：863-877.

［11］Tamagawa K，Taooka Y，Maeda A，et al.Inhibitory effects of a lecithinized superoxide dismutase on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］.Am J Respir Criti Care Med，2000，161（4 Pt 1）：1279-1284.

［12］程真順，徐啟勇，葉燕青，等.ICAM-1在實(shí)驗(yàn)性肺間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及鹽酸氨溴索的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，26（6）：730-733.

［13］Nakao A，Hasegawa Y，Tsuchiya Y，et al.Expression of cell adhesion molecules in the lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Chest，1995，108（1）：233-239.

［14］Hamaguchi Y，Nishizawa Y，Yasui M，et al.Intercellular adhesion molecule-1 and L-selectin regulate bleomycin-induced lung fibrosis［J］.Am J Pathol，2002，161（5）：1607-1618.

［15］Tadacs P，Kauma SW，Sholley MM，et al.Increased circulating lipid peroxides in severe preclampsia activate NF-kappaB and upregulate ICAM-1 in vascular endothelial cells［J］.FASEB J，2001，15（2）：279-281.

［16］馬躍文，佟振月，侯顯明，等.肺纖維化過(guò)程中不同種類膠原異常沉積及分布規(guī)律的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38（6）：407-409.

（編輯 陳姜）

Expression and Significance of Nuclear Factor-κBand Intercellular Adhesion Molecule-1 in Radiation-induced Lung Injury

ZHANGZhen-yong1，CAOQiu-ting2，WURong1
（1.Department of Medical Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China；2.Department of Oncology，Xinhua Hospital Affiliated Dalian University，Dalian 116021，China）

ObjectiveTo discuss the expression ofnuclearfactor-κB（NF-κB）and intercellularadhesion molecule-1（ICAM-1）in radiationinduced lung injury，and their mechanisms in the genesis and development of radiation-induced lung injury.MethodsWistar rats were used in the experiment.Rats in treatment groups received X-ray irradiation（15 Gy irradiation group and 20 Gy irradiation group），whereas those in the nonirradiated group did not.After28 days，NF-κB and ICAM-1 expression in the radioactive lung injury in rats was tested using immunohistochemistry，and immunohistochemicalstaining was quantitatively determined using the computerimage analysis system.ResultsNF-κBexpression in the nonirradiated group was a little，and itincreased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The difference in the NF-κB expression between the irradiated and non-irradiated groups was statistically significant（P＜0.001）；and that between the two irradiation groups was also statistically significant（P＜0.001）.ICAM-1 expression was little in the non-irradiated group；however，it increased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The differences in the ICAM-1 expression in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups were statistically significant compared with that in the non-irradiated group（P＜0.001）.However，the difference in ICAM-1 expression between the two irradiation groups were statistically non-significant（P＜0.05）.ConclusionNF-κB and ICAM-1 are the key factors that lead to acute radiation-induced lung injury.By reducing NF-κB activity and regulating ICAM-1 expression，radiation-induced lung injury can be reduced，which provides a new therapeutic targetforthe prevention and treatmentofradiation-induced lung injury.

nuclear factor-κB；intercellular adhesion molecule-1；radiation-induced lung injury

R818.74

A

0258-4646（2014）02-0155-04

張振勇（1977-），男，主治醫(yī)師，碩士.通信作者：吳榮，E-mail：wur@sj-hospital.org

2013-11-13

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