（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110032）

培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型水通道蛋白5表達(dá)的影響

苗蘭英，王艷杰，郭雋馥，曹陽(yáng)，趙丹玉，柳春

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110032）

目的觀察培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織水通道蛋白5（AQP5）表達(dá)的影響，探討脾虛對(duì)哮喘氣道黏液高分泌形成的影響及培土生金法對(duì)其的調(diào)控作用。方法50只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、脾虛哮喘組、哮喘組、脾虛哮喘治療組、哮喘治療組，每組10只。采用RT-PCR測(cè)定大鼠肺組織AQP5mRNA表達(dá)水平，采用免疫組化測(cè)定肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平。結(jié)果脾虛哮喘組、哮喘組與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織AQP5mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論培土生金法能夠升高脾虛哮喘和哮喘時(shí)肺組織AQP5mRNA和蛋白表達(dá)水平。

培土生金；脾虛；哮喘；水通道蛋白；氣道黏液高分泌

哮喘是呼吸系統(tǒng)中常見(jiàn)的慢性疾病，氣道黏液高分泌是其主要的病理生理特征之一。氣道黏液的黏彈性主要取決于黏蛋白，但是黏蛋白的分泌與水和電解質(zhì)的分泌是相互調(diào)節(jié)的，黏蛋白的絕對(duì)量增多與黏蛋白和水鹽的比例失衡有關(guān)［1，2］。水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）可能參與了黏蛋白表達(dá)和分泌，從而參與了氣道黏液高分泌的形成。AQP5可能成為治療哮喘、肺囊性纖維化等氣道黏液高分泌疾病的新靶點(diǎn)。本課題組前期研究表明，培土生金中藥可以顯著降低脾虛哮喘大鼠和哮喘大鼠BALF和肺組織中黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）的含量和表達(dá)，抑制哮喘大鼠肺組織核因子κB p65的活性，從而減少氣道黏液的黏蛋白含量，減輕氣道炎癥，改善氣道黏液高分泌［3，4］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察培土生金中藥對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5表達(dá)的影響，探討脾虛對(duì)哮喘氣道黏液高分泌形成的影響機(jī)制及培土生金中藥對(duì)AQP5的調(diào)控作用，為研究培土生金中藥治療脾虛哮喘的機(jī)制開(kāi)辟新領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，體質(zhì)量（200±20）g，周齡6～8周。許可證編號(hào)：SCXK（京）2007-0001。按隨機(jī)數(shù)字法分成5組：對(duì)照組、脾虛哮喘組、哮喘組、脾虛哮喘治療組和哮喘治療組，每組10只。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵蛋白（貨號(hào)GradeⅡ，A5253，美國(guó)Sigma公司），兔抗大鼠AQP5一抗（武漢博士德生物工程有限公司），Trizol Reagent、TaKaRa RNA PCR試劑盒（TaKaRa大連寶生物公司），WD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一儀器廠），電泳儀（EPS300型，上海天能科技有限公司），KCW-6T超聲霧化器（南京杰西電器有限公司），低溫高速冷凍離心機(jī)（TGL-20M型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），手動(dòng)石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)（EG1150C型，德國(guó)LEICA公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立和評(píng)價(jià)：脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組參考文獻(xiàn)［5］的方法并改進(jìn)，連續(xù)10 d采用飲食不節(jié)、過(guò)度疲勞和苦寒泄下等方法共同作用，建立脾虛大鼠模型。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)體質(zhì)量下降、進(jìn)水量增多、進(jìn)食量減少、肛溫升高、排便次數(shù)增多、便溏、倦怠少動(dòng)、游泳耐力下降、皮毛光澤度下降等變化，提示脾虛模型造模成功。脾虛造模成功后，脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組再與哮喘組、哮喘治療組一起采用致敏和激發(fā)的方法建立哮喘模型。在實(shí)驗(yàn)的第11、13和15天，腹腔注射抗原液1 mL致敏（由卵蛋白100 mg、滅活百日咳桿菌疫苗5×109個(gè)、氫氧化鋁凝膠100 mg的生理鹽水溶液配制而成）。致敏后第15天開(kāi)始將大鼠放入霧化箱內(nèi)，每日將1%卵蛋白溶液用超聲霧化器噴霧激發(fā)，每次30 min，共7 d。當(dāng)激發(fā)時(shí)大鼠出現(xiàn)呼吸喘促、點(diǎn)頭、腹肌抽動(dòng)等呼吸困難癥狀，提示哮喘模型造模成功。

1.2.2 處理因素：造模成功后用培土生金中藥，由黃芪、人參、防風(fēng)、白術(shù)等9味中藥按比例組成，常規(guī)煎煮2次，去渣留液，濃縮為1 g/mL生藥。按照人鼠劑量換算，折合成人的等效劑量的10倍。從實(shí)驗(yàn)的第11天開(kāi)始對(duì)脾虛哮喘治療組和哮喘治療組進(jìn)行灌胃，2次/d，每次1 mL/100 g體質(zhì)量，連續(xù)21 d。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.1 大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值的測(cè)定：右肺下葉稱量濕質(zhì)量后，放入56℃恒溫箱烤干，72 h后（至衡質(zhì)量后）稱干質(zhì)量，計(jì)算濕/干質(zhì)量比值。

1.3.2 大鼠肺組織AQP5mRNA表達(dá)：采用Trizol進(jìn)行肺組織總RNA提取，采用RT-PCR試劑盒分兩步進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。內(nèi)參照β-actin和AQP5［6］的引物序列：上游5′-CAGCACTCAAGTGGCCCTCGGCTC -3′，下游5′-AAAGATCGGGCTGGGTTCATGGAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度500 bp。β-actin引物序列：上游5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度592 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性，2 min；94℃變性，30 s；65℃退火，30 s；72℃延伸，1 min；72℃延伸，5 min；瓊脂糖凝膠電泳；利用WD-9413B凝膠成像分析儀進(jìn)行圖像分析，用Gelpro32軟件測(cè)量目的基因和內(nèi)參的平均光密度值，并計(jì)算兩者的比值，以該比值反映目的基因的mRNA表達(dá)水平。

1.3.3 大鼠肺組織AQP5的表達(dá)：采用免疫組化SABC法測(cè)定肺組織AQP5表達(dá)，采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，選取200倍圖像，細(xì)胞質(zhì)或胞膜著棕黃色為AQP5陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行平均光密度測(cè)定，取其平均值作為該切片的代表值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織濕/干質(zhì)量比值的影響

肺組織濕/干質(zhì)量比值是用來(lái)評(píng)估肺水腫或肺水失衡的指標(biāo)。脾虛哮喘組、哮喘組與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，肺組織濕/干質(zhì)量比值均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織濕/干質(zhì)量比值均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5mRNA表達(dá)的影響

脾虛哮喘組、哮喘組與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織

AQP5mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5蛋白表達(dá)的影響

AQP5主要表達(dá)在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞及黏膜下腺。脾虛哮喘組、哮喘組與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 培土生金法對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織濕/干質(zhì)量比值及AQP5mRNA和蛋白表達(dá)的影響Tab.1 The effect of“reinforcing earth to strengthen metal”on lung wet/dry weight ratio，AQP5 mRNA and protein in rats′lung in spleen?deficiency bronchial asthma

3 討論

哮喘是以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、黏液高分泌及氣道重塑為主要病理特征的慢性呼吸道疾病。氣道黏液高分泌的形成與黏蛋白和水鹽比例失調(diào)導(dǎo)致黏液變得稠厚有關(guān)。AQPs、氯通道和鈉通道等上皮通道蛋白都參與了呼吸道的水鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)于調(diào)節(jié)氣道表面液體的成分和厚度等都有重要作用。目前的研究表明，AQP5主要表達(dá)在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞和黏膜下腺細(xì)胞［7，8］。AQP5是黏膜下腺體液體分泌的主要參與者，黏膜下腺AQP5的減少能導(dǎo)致氣道液體分泌減少及黏蛋白濃度增加［9］，AQP5的表達(dá)在哮喘發(fā)病過(guò)程中對(duì)改變氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌起著關(guān)鍵作用［10，11］。陳智鴻等［12］研究表明，AQP5的基因缺失可使小鼠氣道對(duì)過(guò)敏原的應(yīng)激性增加。另有研究報(bào)道，AQP5與氣道高反應(yīng)性、氣流受限、調(diào)節(jié)氣道水穩(wěn)態(tài)有關(guān)［13］。以上研究結(jié)果表明AQP5參與了氣道黏液分泌，與氣道黏液高分泌的形成密切相關(guān)，并且與氣道高分壓有關(guān)。因此深入研究AQP5與氣道黏液高分泌形成及其與氣道黏蛋白表達(dá)和分泌調(diào)控的相關(guān)性，必將為氣道黏液高分泌疾病的研究提供靶點(diǎn)。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)很早就對(duì)體內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝進(jìn)行了描述，把體內(nèi)一切正常水液稱為津液，包括各臟腑組織的內(nèi)在體液和其正常分泌物。津液的生成、輸布和排泄與各臟腑功能密切相關(guān)，特別是肺脾腎三臟。脾為后天之本，主運(yùn)化水液，為津液代謝之樞紐。脾能將津液上輸于肺或直接布散全身，以灌四旁。脾失健運(yùn)，則水濕內(nèi)停，而至水飲，痰飲，水瀉。脾虛時(shí)津液代謝紊亂，影響肺的呼吸功能。氣道黏液是氣道內(nèi)正常的分泌物，應(yīng)屬于中醫(yī)學(xué)中的“津液”，氣道黏液高分泌是津液代謝紊亂的結(jié)果。王艷杰等［3，14］前期實(shí)驗(yàn)研究表明，脾虛能夠使肺組織MUC5AC表達(dá)水平進(jìn)一步升高及AQP5表達(dá)進(jìn)一步降低，說(shuō)明脾虛能影響肺組織的津液代謝，引起氣道黏液高分泌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察脾虛哮喘大鼠模型肺AQP5表達(dá)變化，進(jìn)一步揭示哮喘氣道黏液高分泌形成機(jī)制和培土生金法治療哮喘的機(jī)制，為揭示脾與肺在水液代謝中的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為“脾主運(yùn)化水液”提供分子基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：脾虛能夠使哮喘大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值進(jìn)一步升高，并且還能夠使肺組織AQP5mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低。脾虛哮喘和哮喘時(shí)肺組織AQP5的表達(dá)水平和支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC含量及肺組織MUC5AC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，加重哮喘時(shí)的肺水失衡，說(shuō)明肺組織AQP5表達(dá)水平和氣道黏液中的MUC5AC含量及肺組織MUC5AC表達(dá)水平密切相關(guān)。由此推測(cè)哮喘時(shí)肺組織AQP5表達(dá)水平降低，可能是導(dǎo)致氣道黏蛋白表達(dá)增高和黏蛋白分泌過(guò)多的原因之一。脾虛能夠加重哮喘氣道黏蛋白的表達(dá)和分泌，可能是通過(guò)改變AQP5的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。培土生金中藥能夠使脾虛哮喘模型和哮喘模型組大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值降低，肺組織AQP5mRNA和蛋白表達(dá)水平

升高，從而使支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC含量降低，肺組織MUC5AC表達(dá)降低。培土生金法是通過(guò)調(diào)控肺組織AQP5的表達(dá)，調(diào)節(jié)黏蛋白的分泌，改善氣道黏液高分泌。

［1］Rose MC，Voynow JA.Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease［J］.Physiol Rev，2006，86（1）：245-278.

［2］Williams OW，Sharafkhaneh A，Kim V，et al.Airway mucus from production to secretion［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34（5）：527-536.

［3］王艷杰，柳春，趙丹玉，等.補(bǔ)脾益氣方對(duì)脾虛哮喘大鼠肺組織黏蛋白5AC表達(dá)的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31（9）：1568-1570.

［4］柳春，王艷杰，趙丹玉，等.補(bǔ)脾益氣方藥對(duì)脾虛哮喘大鼠肺組織IκB/NF-κB信號(hào)途徑的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（10）：36-38.

［5］李德新，李曉明，易杰，等.脾虛證對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)與功能影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，1993，20（6）：39-43.

［6］Ko SB，Naruse S，Kitagawa M，et al.Aquaporins in rat pancreatic interlobular ducts［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2002，282（2）：G324-G331.

［7］Kreda SM，Gynn MC，F(xiàn)enstermacher DA，et al.Expression and localization of epithelial aquaorins in the adult human lung［J］.AM J Respir Cell Mol Biol，2001，24（3）：224-234.

［8］King LS，Nielsen S，Agre P.Aquaporins and the respiratory system：advice for a lung investigator［J］.J Clin Invest，2000，105（1）：15-16.

［9］Wang K，F(xiàn)eng YL，Wen FQ，et al.Decreased expression of human aquaporin-5 correlated with mucus overproduction in airways of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（8）：1166-1174.

［10］董春玲，魯繼榮，王桂芳，等.哮喘小鼠肺組織中水通道蛋白5和黏蛋白AC表達(dá)變化及其相關(guān)性研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（24）：2961-2970.

［11］Shen Y，Wang Y，Chen Z，et al.Role of aquaporin 5 in antigen induced airway inflammation and mucons hyperproduction in mice［J］.J Cell Mol Med，2011，15（6）：1355-1363.

［12］陳智鴻，沈瑤，董春玲，等.水通道蛋白敲除對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道黏蛋白譜表達(dá)的影響［J］.中華哮喘雜志，2009，3（3）：159-163.

［13］董春玲，魯繼榮，王桂芳，等.地塞米松對(duì)哮喘小鼠肺液清除功能障礙的作用［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8（1）：24-27.

［14］王艷杰，趙丹玉，王德山，等.脾虛型哮喘大鼠肺組織水通道蛋白5表達(dá)變化和機(jī)制的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（12）：909-911.

（編輯 陳姜）

The Effectof“Reinforcing Earth to Strengthen Metal”on Aquaporin 5 Expression in Ratswith Spleen-deficiency in BronchialAsthma

MIAOLan-ying，WANG Yan-jie，GUOJuan-fu，CAO Yang，ZHAO Dan-yu，LIUChun
（DepartmentofBiochemistry and MolecularBiology，Liaoning University ofTraditionalChinese Medicine，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo observe the effect of“reinforcing earth to strengthen metal”on aquaporin 5（AQP5）expression in rats with spleendeficiency in bronchialasthma，and analyze the relationship ofspleen-deficiency with airway mucus hypersecretion formation and the effective mechanism of the“reinforcing earth to strengthen metal”method.Methods50 healthy male Wistar rats were randomly divided into 5 groups：control group，spleen-deficiency asthma group，asthma group，spleen-deficiency asthma treatment group，and asthma treatment group（n=10）.Expression of AQP5mRNAin the lung was detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），and AQP5 protein expression was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of AQP5mRNA and protein in the lung tissue of rats was significantly decreased in spleen deficiency asthma group comparing with the asthma group（P＜0.01）.The expression level of AQP5mRNA and protein in lung tissue was significantly increased in spleen deficiency asthma treatment group and asthma treatment group comparing with spleen deficiency asthma group and asthma group，respectively（P＜0.01）.ConclusionThe expression level of AQP5mRNA and protein in spleen deficiency asthma or asthma lung tissue can be significantly increased by the treatmentof“reinforcing earth to strengthen metal”.

reinforcing earth to strengthen metal；spleen-deficiency；asthma；aquaporin；airway mucus hypersecretion

R285.5

A

0258-4646（2014）02-0118-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81202789）；遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（2009A500）；遼寧省博士啟動(dòng)基金（20111134）

苗蘭英（1966-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科.

王艷杰，E-mail：wangyj76@yahoo.com.cn

2013-12-10

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：