（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng)110004）

甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)的生物學(xué)意義

劉臻，滕緒永，張恒瑋，張雷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng)110004）

目的研究甲狀腺乳頭狀癌組織中趨化因子受體CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)，探討其表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中作用。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)79例甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織標(biāo)本中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)，分析CXCR7表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為1.61±0.80和1.101 4±0.693 8，明顯高于癌旁組織的0.74±0.45和0.092 7±0.096 1（均P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為1.87±0.72和1.444 3±0.671 0，明顯高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的1.30±0.79和0.691 7±0.463 9（均P＜0.05）；CXCR7蛋白表達(dá)與TNM分期相關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期中CXCR7蛋白表達(dá)為1.534 1±0.673 2，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的0.954 6±0.642 1（P＜0.05）。結(jié)論CXCR7高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期相關(guān)，參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展。

甲狀腺腫瘤；趨化因子受體；CXCR7；轉(zhuǎn)移

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%。甲狀腺乳頭狀癌易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。越來越多的研究顯示趨化因子及其受體網(wǎng)絡(luò)參與了腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)。CXCR7是近年來發(fā)現(xiàn)的趨化因子受體，與其配體CXCL12結(jié)合后能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生存、黏附等功能，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［1～5］。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及相應(yīng)癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)，探討CXCR7在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2010年6月5日至2011年11月18日在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普外科行手術(shù)治療患者的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本79例，留取癌組織及癌旁2 cm組織，置液氮后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。癌旁2 cm組織經(jīng)病理證實(shí)未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有留取的標(biāo)本

均獲患者知情同意，并且有完整的臨床資料。

1.2 主要儀器與試劑

PCR引物、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR染料法實(shí)時(shí)PCR試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa公司。兔抗人CXCR7抗體，購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。小鼠抗人GAPDH抗體，購(gòu)自上?？党缮锕?。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成：取60 mg組織標(biāo)本，于液氮研磨成粉末，加入1 mL Trizol，勻漿處理。按照Trizol試劑說明書，一步法提取組織總RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，各樣本的A260/A280比值在1.8～2.0，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。提取的總RNA保存于-80℃，用于逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件均參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s。合成的cDNA于-20℃下保存，待擴(kuò)增。

1.3.2 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)：實(shí)時(shí)PCR在ABI7500 Realtime PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系20 μL：SYBR預(yù)混液10 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1 μL，校正液ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2 μL，雙蒸水5.6 μL。擴(kuò)增條件：95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。目的基因CXCR7引物：上游為5′-AGCATCAAGGAGTGGCTGAT-3′，下游為5′-TGTGCTTCTCCTGGTCACTG-3′，產(chǎn)物136 bp；內(nèi)參照基因GAPDH引物：上游為5′-ACAGTCAGCCG CTTCTT-3′，下游為5′-GCCCAATACGACC AAATCC-3′，產(chǎn)物101 bp。根據(jù)熒光信號(hào)，檢測(cè)出每個(gè)反應(yīng)體系中待測(cè)基因的Ct值。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，取Ct值的平均值進(jìn)行分析。CXCR7的基因相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法來分析。具體公式：△△Ct=［CtCXCR7（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）］-［CtCXCR7（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）］，以癌旁組織的平均Ct值作為校正，陰性對(duì)照用雙蒸水代替cDNA模板。

1.4 Western blot檢測(cè)

取80 mg組織標(biāo)本，加入蛋白裂解液1 mL，勻漿裂解，12 000 g、4℃、10 min離心后，取上清液測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸變性5 min，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉60 min，用1∶400的兔抗人CXCR7單克隆抗體于4℃孵育過夜，另用1∶15 000的鼠抗人GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參。加入相應(yīng)的二抗（1∶2 000），室溫下孵育90 min。底物化學(xué)發(fā)光ECL呈色。采用IPP圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以IOD的比值（CXCR7的IOD值/GAPDH的IOD值）作為CXCR7蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達(dá)

2.1.1 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中CXCR7 mRNA表達(dá)：甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中，CXCR7mRNA的陽(yáng)性標(biāo)本熒光定量擴(kuò)增曲線呈典型的S型曲線（圖1），溶解曲線為單峰（圖2），排除非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的出現(xiàn)。甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中CXCR7mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.61±0.80和0.74±0.45，甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.736，P＜0.05）。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7mRNA熒光定量擴(kuò)增曲線Fig.1 The amplification curves of CXCR7 mRNA acquired from real?time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

圖2 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7 mRNA熒光定量融解曲線Fig.2 The melt curves of CXCR7 mRNA acquired from real?time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

2.1.2 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7蛋白的表達(dá)：與相應(yīng)的癌旁組織相比，CXCR7蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的表達(dá)明顯升高，CXCR7蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的相對(duì)表達(dá)量為1.101 4±0.693 8，在癌旁組織中為0.092 7±0.096 1，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.583，P＜0.05）（圖3）。

2.2 CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系

圖3 Western blot檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織CXCR7蛋白Fig.3 Detection of CXCR7 protein in PTC and paracancerous tissue by Western blot

CXCR7mRNA表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中CXCR7 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.87±0.72和1.30±0.79，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.356，P＜0.05）。CXCR7蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中CXCR7蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.444 3±0.671 0和0.691 7±0.463 9（t=5.868，P＜0.05），TNMⅢ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期組CXCR7蛋白表達(dá)量分別為1.534 1± 0.673 2和0.954 6±0.642 1（t=3.446，P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、病灶數(shù)目、被膜外侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between expressions of CXCR7 mRNA and protein and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

3 討論

趨化因子及其受體是一類重要的細(xì)胞因子，不僅參與胚胎發(fā)育、炎癥、造血，而且參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移［6］。CXCR7是近年新發(fā)現(xiàn)的趨化因子受體，與其配體CXCL12結(jié)合后在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［7，8］。研究報(bào)道，CXCR7高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞系及多種惡性腫瘤，但正常細(xì)胞和相應(yīng)的非惡性轉(zhuǎn)化的組織幾乎不表達(dá)CXCR7蛋白，只能通過Northern blot檢測(cè)到CXCR7mRNA的表達(dá)，并推測(cè)CXCR7蛋白是通過翻譯后方式進(jìn)行調(diào)節(jié)［7～10］。我們之前采用免疫組化方法檢測(cè)了甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中CXCR7和CXCL12蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中CXCR7和CXCL12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，CXCR7和CXCL12蛋白陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；且CXCR7和CXCL12蛋白表達(dá)呈正相關(guān)趨勢(shì)，提示CXCR7和CXCL12參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展［11］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot進(jìn)一步檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白水平的表達(dá)，無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平上，CXCR7在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，表明在甲狀腺乳頭狀癌中CXCR7在轉(zhuǎn)錄水平即開始調(diào)節(jié)，這與Burns等［7］和邱明遠(yuǎn)等［12］提出的CXCR7的表達(dá)是通過翻譯后修飾或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)行調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)不同，提示在不同組織中CXCR7表達(dá)的調(diào)控方式可能不同。

研究報(bào)道CXCR7能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、血管生成及細(xì)胞間黏附，參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移［7，9，13］。邱明遠(yuǎn)等［12］報(bào)道，結(jié)直腸癌組織中CXCR7蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。Iwakiri等［2］報(bào)道在Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌中，CXCR7高表達(dá)與術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和低生存率相關(guān)。本研究分析了CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的CXCR7mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移組，而且CXCR7蛋白表達(dá)和臨床分期有關(guān)，TNMⅢ～Ⅳ期中CXCR7的蛋白表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，提示CXCR7高表達(dá)可能對(duì)甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)侵襲、轉(zhuǎn)移起到一定的促進(jìn)作用。本研究中CXCR7 mRNA和蛋白表達(dá)水平與臨床分期的關(guān)系不一致，可能與本組病例數(shù)少有關(guān)，也提示在甲狀腺乳頭狀癌中CXCR7蛋白表達(dá)除了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄后也可能存在調(diào)控，需要進(jìn)一步研究。目前CXCR7在腫瘤中的作用機(jī)制還不是很清楚，Wang等［14］在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR7可能通過激活A(yù)KT信號(hào)通路和上調(diào)白細(xì)胞介素8或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來調(diào)控腫瘤的血管生成及發(fā)展；并可調(diào)節(jié)鈣黏連蛋白11、纖維連接蛋白1及基質(zhì)金屬蛋白酶3、10、11等的水平，增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。Grymula等［15］報(bào)道CXCR7能通過誘導(dǎo)MAPK p42/44DE磷酸化來促進(jìn)橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。Barbero等［16］發(fā)現(xiàn)CXCR7還能通過活化ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。這些研究均表明CXCR7能通過多種途徑增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性及轉(zhuǎn)移性。

綜上所述，CXCR7高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期相關(guān)，參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。選擇性阻斷CXCR7，可能是控制甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)有效途徑。

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（編輯 陳姜）

Expression of Chemokine Receptor CXCR7in Papillary Thyroid Carcinoma and Its BiologicalSignificance

LIU Zhen，TENGXu-yong，ZHANGHeng-wei，ZHANGLei
（DepartmentofGeneralSurgery，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the mRNA and protein expression of chemokine receptor CXCR7in papillary thyroid carcinoma and explore its biologicalfunction.MethodsThe expression of CXCR7mRNAand protein in 79 cases ofpapillary thyroid carcinoma and paracancerous tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot.The association between CXCR7expression and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma was analyzed.ResultsThe expression of CXCR7 mRNA and protein（1.61±0.80，1.101 4±0.693 8）was significantly higher in papillary thyroid carcinoma than in paracancerous tissues（0.74±0.45，0.092 7±0.096 1）（P＜0.05）.The expression of CXCR7mRNA and protein was correlated with lymph node metastasis.The expression level of CXCR7 mRNA and protein in the group with lymph node metastasis（1.87±0.72，1.444 3±0.671 0）was higherthan in the group withoutlymph node metastasis（1.30±0.79，0.691 7±0.463 9）（P＜0.05）.The levelof CXCR7 protein was relevant to TNM stages.The level of CXCR7 protein in stageⅢ-Ⅳ（1.534 1±0.673 2）was higher than in stageⅠ-Ⅱ（0.954 6± 0.642 1）（P＜0.05）.ConclusionThe high expression of CXCR7was related with lymph node metastasis and TNM stages.CXCR7may be involved in the tumorigenesis and progression ofpapillary thyroid carcinoma.

thyroid neoplasm；chemokine receptor；CXCR7；metastasis

R736.1

A

0258-4646（2014）02-0114-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81072182）；遼寧省自然科學(xué)基金（2013021100）

劉臻（1973-），男，副教授，博士.

E-mail：liuzhen1973@aliyun.com

2013-12-19

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：