王 勃，劉 昕，馬 濤,*，劉 賀，何余堂，惠麗娟

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧 錦州 121013；2.沈陽農業(yè)大學食品 學院，遼寧 沈陽 110866）

響應面法優(yōu)化脈沖強光對面包表面細菌的殺菌工藝

王 勃1，劉 昕2，馬 濤1,*，劉 賀1，何余堂1，惠麗娟1

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧 錦州 121013；2.沈陽農業(yè)大學食品 學院，遼寧 沈陽 110866）

采用響應面法分析優(yōu)化脈沖強光對面包表面殺菌的工藝參數。在單因素試驗的基礎上，選取閃照次數、閃照距離、閃照能量為影響因素，殺菌率為響應值，應用Box-Behnken試驗設計建立數學模型，進行響應面分析。結果表明：優(yōu)化條件為閃照次數30 次、閃照距離9 cm、閃照能量400 J，此時脈沖強光對面包表面的細菌殺菌率可達到99.99%，檢測面包表面的細菌殘留量遠遠小于1 500 CFU/g，符合國標有關規(guī)定，因此該模型可應用于實際生產。

脈沖強光；面包；菌落總數；殺菌率

脈沖強光殺菌是一種新興的非熱型殺菌技術，它利用瞬時、高強度、廣波譜的脈沖光能量來殺滅食品中的微生物，具有殺菌均勻、操作安全、減少環(huán)境污染等優(yōu)點[1]。高強度的脈沖強光可以迅速有效地滅活微生物[2]。脈沖強光是可見光、紅外線和紫外線協(xié)同作用于微生物，破壞細菌的細胞壁，使細胞液蒸發(fā)，徹底破壞細胞結構，導致死亡。

該技術由于只處理食品的表面，從而對食品的風味和營養(yǎng)成分影響很小，可用于延長以透明物料包裝的食品及新鮮食品的貨架期，很有發(fā)展前途[3]。目前，國外對脈沖強光殺菌技術研究較多：Funes等[4]的研究認為脈沖強光殺菌是減少污染在蘋果中的棒曲霉素的一種潛在殺菌方法。Aguiló-Aguayo等[5]的研究表明脈沖強光可以有效減少新鮮西紅柿的微生物污染而不損害其營養(yǎng)價值。國內近幾年才出現(xiàn)關于脈沖強光殺滅微生物的相關研究報道，但大部分都應用于流體[6-8]，有關于焙烤制品目前尚無報道。

面包豐富的營養(yǎng)成分適宜微生物生長繁殖，制作過程中滅菌不徹底及包裝貯藏不當都可造成微生物超標[9]，影響面包食用安全，縮短貨架期。面包生產普遍依靠添加防腐劑或者利用不同包裝形式來延長其保質期[10-11]，在這個談防腐劑色變的社會，選擇一種安全、高效、低成本的殺菌方式勢在必行。本實驗采用脈沖強光殺菌技術，以閃照次數、閃照距離和閃照能量為參數，利用響應面法對面包表面細菌的殺菌條件進行優(yōu)化，為降低面包表面初始菌量、延長其貨架期及提高其食用安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包（配料為小麥粉、酵母、雞蛋、食用鹽、白砂糖） 遼寧省沈陽桃李食品股份有限公司；均質袋（25 cm×17 cm） 廣州市鴻呈科貿易有限公司；平板計數培養(yǎng)基（BR） 北京奧博星生物計數有限責任公司。

1.2 儀器與設備

ZWB-I-01（LA50-800H）脈沖強光殺菌器 寧波中物光電殺菌技術有限公司；GMSX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫試驗儀器廠；MiniMix400W拍打均質器 法國Interscience公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；EC2菌落計數儀 法國梅里埃生物公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在無菌操作臺中使用電子天平準確稱量25.0 g面包樣品（規(guī)格約為8 cm×8 cm，厚度為1 cm）。按照實驗條件進行脈沖強光單燈處理，而后放入盛有225 mL無菌生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質機拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液，搖勻液進行活菌平板計數。之后按照GB 4789.2-2010《食品微生物檢測：菌落總數的測定》進行樣品稀釋、菌落培養(yǎng)及總數的測定[12]。

取同等質量的面包不做任何處理，培養(yǎng)2 d后得到的活菌數即為對照樣品平均菌落數。脈沖強光的殺菌效果依據微生物的殺菌率來評價，殺菌率的計算公式如下：

式中：A0為對照樣品平均菌落數，A為被試樣品平均菌落數。

1.3.2 單因素試驗

選取閃照次數、閃照距離、閃照能量為試驗影響因素，閃照頻次為2 次/s。固定其中兩個因素條件，分別對另外一個影響因素進行試驗[13-14]。每個影響因素做3 次平行試驗。

固定閃照次數30 次、閃照能量400 J，研究閃照距離為9、10、11、12、13 cm對面包殺菌效果的影響。固定閃照距離10 cm、閃照能量400 J，研究閃照次數為10、15、20、25、30 次對面包殺菌效果的影響。固定閃照次數30 次、閃照距離10 cm，研究閃照能量100、200、300、400、500 J對面包殺菌效果的影響。

1.3.3 響應面法優(yōu)化脈沖強光對面包表面殺菌效果

根據單因素試驗結果，以閃照次數（X1）、閃照距離（X2）、閃照能量（X3）3 個因素為自變量，在前期單因素試驗基礎上設定試驗因素和水平值，以菌落的殺菌率為響應值進行響應面試驗設計[15-17]。根據Box-Behnken試驗設計原理[18]，通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行分析，預測脈沖強光殺菌的最佳工藝條件。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 閃照次數對面包表面細菌殺菌效果的影響

圖1 閃照次數對殺菌效果的影響Fig.1 Effect of flash time on sterilization efficiency

由圖1可以看出，隨著閃照次數的增大，殺菌率呈增加趨勢。在閃照次數為10～20 次時，殺菌率提升的較為顯著，在20～30 次時，殺菌率提高趨緩。閃照次數為25 次時，其殺菌率為99.59%，所殘留的微生物菌落總數符合國標規(guī)定。考慮到節(jié)約能源，盡量使機器照射時間縮短，閃照次數在25 次時即可達到最佳的殺菌效果。

2.1.2 閃照距離對面包表面細菌殺菌效果的影響

圖2 閃照距離對殺菌效果的影響Fig.2 Effect of flash distance on sterilization efficiency

由圖2可以看出，隨著閃照距離的增大，殺菌率呈減少趨勢。這是因為隨著脈沖強光與面包的距離越遠，其

殺菌效果越弱[19]。根據殺菌率的變化可以看出在閃照距離為9～10 cm時，殺菌效果幾乎相同，距離增加會擴大殺菌面積，從而在實際應用中提高殺菌效率，因此閃照距離為10 cm時殺菌效果最好。

2.1.3 閃照能量對面包表面細菌殺菌效果的影響

圖3 閃照能量對殺菌效果的影響Fig.3 Effect of flash energy on sterilization efficiency

由圖3可以看出，隨著閃照能量的增加，殺菌率呈增加趨勢。在閃照能量為200～300 J時，殺菌率明顯提高，而在400～500 J時，殺菌效果相差甚微，殺菌率提升的也不顯著。在保證殺菌效果的前提下，降低功率可以節(jié)約能源及儀器損耗，因此當閃照能量為400 J時殺菌效果最佳[20]。

2.2 試驗模型的建立及顯著性檢驗

應用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken試驗設計，以閃照次數、閃照距離、閃照能量為因素，以微生物殺菌率為響應值（Y），進行響應面試驗，試驗設計及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results for sterilization efficiency

根據表2結果，將試驗數據進行逐步回歸擬合，得到以殺菌率（Y）為目標函數的二次回歸方程模型為：

對該數學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數?；貧w模型進行方差分析及可信度分析結果見表3。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted mathematical model

根據表3可知，模型P＜0.000 1，表示模型極顯著，說明該模型成立，本試驗方法可靠。失擬項不顯著（P=0.959 3＞0.05），表明回歸方程無失擬因素存在，回歸方程擬合較好。進一步說明在試驗范圍內可以用來解釋和預測實驗結果。一次項X1、X2、X3的影響都是極顯著（P＜0.000 1）；交互項X1X3（P=0.002 8＜0.01）對殺菌率的影響極顯著；交互項X1X2（P=0.091 2＞0.05）、X2X3（P=0.967 6＞0.05）對殺菌率的影響不顯著。綜上所述，影響因素的主次順序為：X1（閃照次數）＞X3（閃照能量）＞X2（閃照距離）。模型的校正決定系數（R2Adj）為0.988 6，說明該模型能解釋98.86%的響應值的變化，該方程與實際擬合的較好，能有效反應脈沖強光殺菌率與閃照次數、閃照距離和閃照能量之間的關系，因此所得的方程能預測響應值隨各參數的變化規(guī)律[21-24]。閃照距離、閃照次數、閃照能量之間交互作用對殺菌率的影響見圖4。

根據編碼公式求出自變量X1、X2、X3的編碼值為x1=1，x2=0.579，x3=0.745，對應的真實值為X1=30、X2=9.42、X3=374.52，即閃照次數30 次、閃照距離9.42 cm、閃照能量374.52 J，考慮到實際操作，將最佳條件修正為閃照次數30 次、閃照距離9 cm、閃照能量400 J，為檢驗響應面的可靠性，在最佳殺菌條件下進行驗證實驗，3 次平行實驗取平均值，脈沖強光殺菌率

為99.99%，檢測到面包樣品表面的細菌殘留量幾乎為0 CFU/g，遠小于國標規(guī)定的1 500 CFU/g[25]。與對照樣品相比，其 菌落總數降低差異較為顯著，結果接近預測值，說明回歸方程能比較真實地模擬各因素對脈沖強光殺菌率的影響，證明該模型合理有效，具有一定的實際指導意義。

圖4 各因素交互作用對殺菌率影響的響應面Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of three operating parameters on sterilization efficiency

3 結 論

采用脈沖強光殺菌技術可以有效殺滅面包表面污染的細菌，試驗因素對殺菌效果影響主次順序為：X1（閃照次數）＞X3（閃照能量）＞X2（閃照距離）。在單因素試驗基礎上，利用響應面法對脈沖強光在面包的殺菌條件進行優(yōu)化，建立了閃照次數、閃照距離、閃照能量3 個因素對殺菌率的二次回歸方程模型。經檢驗，模型準確率有效，可以用該模型分析預測各因素對脈沖強光殺菌率的影響。通過響應面優(yōu)化模型確定脈沖強光殺菌的最佳條件為閃照次數30 次、閃照距離9 cm、閃照能量400 J，此條件下脈沖強光對面包表面細菌殺菌率可達到99.99%，檢測面包表面的細菌殘留量遠遠小于1 500 CFU/g，符合國標有關規(guī)定，因此該模型可為實際生產提供理論依據。

[1] 王賀. 冷殺菌技術在食品加工中的應用[J]. 中國新技術新產品, 2012(11): 129.

[2] ELMNASSER N, GUILLOU S, LEROI F, et al. Pulsed-light system as a novel food decontamination technology: a review[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2007, 53(7): 813-821.

[3] 李玉鋒, 馬濤. 食品殺菌新技術[J]. 農產品加工, 2007(1): 89-93.

[4] FUNES G J, GóMEZ P L, RESNIK S L, et al. Application of pulsed light to patulin reduction in mcilvaine buffer and apple products[J]. Food Control, 2013, 30(2): 405-410.

[5] AGUILó-AGUAYO I, CHARLES F, RENARD C M G C, et al. Pulsed light effects on surface decontamination, physical qualities and nutritional composition of tomato fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013, 86: 29-36.

[6] 江天寶. 脈沖強光對生理鹽水中微生物殺滅效果的研究[J]. 海峽藥學, 2009, 21(7): 97-100.

[7] 鐘自力, 桑衛(wèi)國, 劉聯(lián)國. 鮮啤和白糯米酒脈沖強光冷殺菌技術初探[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(3): 259-262.

[8] 袁勇軍, 唐敏, 陳偉, 等. 脈沖強光對連續(xù)流動狀態(tài)下黃酒殺菌效果及品質的影響[J]. 中國釀造, 2011, 30(1): 71-74.

[9] 徐斐, 劉莉萍, 何定兵. 糕點、面包中污染細 菌的分離及菌種的初步鑒定[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 37(2): 45-48.

[10] 靳學敏, 車振明, 任亞妮, 等. 不同包裝形式對面包保質期的影響[J].食品科技, 2010, 35(8): 186-188.

[11] 荊亞玲, 閆立江, 岳桂云. 食品防腐劑復配形式在面包中的防腐應用研究[J]. 中國食品添加劑, 2010(2): 197-200.

[12] 劉秀梅, 盧行安, 劉中學, 等. GB 4789.2—2010 食品微生物檢測: 菌落總數的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[13] 趙晨. 脈沖強光殺菌技術對氨基酸飲料殺菌作用的研究[J]. 福建輕紡, 2012(4): 32-35.

[14] 馬鳳鳴, 李浦, 葉萬軍, 等. 脈沖強光對梨多酚氧化酶鈍化實驗研究[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(6): 159-162.

[15] 馬濤, 陳偉玲. 糙米發(fā)芽浸泡過程中臭氧對微生物滅菌效果的影響[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(2): 245-248.

[16] 蔣靜, 馬濤. 營養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽富集GABA工藝條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(5): 195-199.

[17] 馬濤, 陳偉玲. 工藝條件對發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(6): 289-295.

[18] JOSHI S, YADAV S, DESAI A J. Application of response-surface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis R2[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 41(2): 122-127.

[19] 南楠, 袁勇軍, 戚向陽, 等. 脈沖強光技術及其在食品殺菌中的應用[J].食品工業(yè)科技, 2010, 31(12): 405-408.

[20] 劉昕, 馬濤, 王勃, 等. 脈沖強光對面包表面霉菌殺菌效果的研究[J].食品科技, 2014, 39(3): 116-120.

[21] 夏海濤, 劉玉芬, 苗文軍. 響應面法優(yōu)化山麻楂粗多糖提取工藝[J].食品科學, 2012, 33(20): 128-131.

[22] 袁菊, 張亞寧, 范云鵬, 等. 響應面分析法優(yōu)化蜂膠黃酮脂質體制備工藝[J]. 食品科學, 2012, 33(20): 1-6.

[23] 王會然, 李宗軍. 響應面試驗優(yōu)化擠壓米生產工藝[J]. 食品科學, 2013, 34(8): 113-117.

[24] 郭麗, 鄔應龍. 響應面試驗優(yōu)化交聯(lián)馬鈴薯淀粉制備工藝及體外消化性質特征研究[J]. 食品科學, 2013, 34(8): 76-81.

[25] 孟憲喜, 張正, 胡玉英, 等. GB 7099-2003 糕點、面包衛(wèi)生標準[S].北京: 中國標準出版社, 2003.

Optimization of Pulsed Light Parameters for Enhanced Sterilization of Bacteria on Bread Surface by Using Response Surface Methodology

WANG Bo1, LIU Xin2, MA Tao1,*, LIU He1, HE Yu-tang1, HUI Li-juan1
(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The pulsed light parameters for sterilizing the surface of bread were optimized by response surface methodology (RSM). The impacts of flash number, distance and energy on sterilization efficiency were investigated. The corresponding mathematical model was established by using Box-Behnken design. Results showed that the optimal pulsed light parameters were determined as 30, 9 cm and 400 J for flash number, distance and energy, respectively. Under the optimized conditions, the total number of bacterial colonies on bread was reduced by 99.99%. The number of residual bacterial colonies on the surface of bread was far less than 1 500 CFU/g, meeting the relevant national standards. Therefore, this method can be used in industrial practice.

pulsed light; bread; aerobic plate count; sterilization efficiency

TS201.3

A

1002-6630（2014）18-0074-04

10.7506/spkx1002-6630-201418014

2013-12-02

王勃（1986—），男，實驗員，碩士，研究方向為糧油工程。E-mail：bohai2000@163.com

*通信作者：馬濤（1962—），男，教授，博士，研究方向為糧油工程。E-mail：matao-09@163.com