周　波，田　園，鐘海雁

（1.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004；2.糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南長沙410004；3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004）

吐溫對紅曲黃色素合成代謝的影響

周波1，2，3，田園1，2，3，鐘海雁1，2，3

（1.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004；2.糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南長沙410004；3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004）

研究了四種吐溫對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響。結(jié)果表明：吐溫20和吐溫80對黃色素的合成代謝有一定的促進作用，胞內(nèi)黃色素生成量分別提高12.30%和9.32%，對橘霉素的合成代謝有一定的消除效果，但效果不明顯，而吐溫40和吐溫60對橘霉素的合成代謝有明顯的促進影響，分別能提高橘霉素生成量111.36%和317.44%，對黃色素的合成代謝影響出現(xiàn)不利影響，分別能使胞內(nèi)黃色素生成量下降8.33%和15.23%。研究結(jié)果在一定程度上為紅曲黃色素工業(yè)化液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

吐溫，橘霉素，紅曲黃色素，紅曲霉突變菌株

紅曲發(fā)酵歷史悠久，關(guān)于紅曲方面的研究主要集中在次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用上，許多學(xué)者對紅曲霉菌代謝產(chǎn)物種類及其功能性等方面做了較多研究，其中紅曲色素是研究較多且應(yīng)用廣泛的主要次級代謝產(chǎn)物[1-2]。紅曲色素作為食品著色劑，具有上千年使用歷史的原因之一就是其不具生物毒性。目前完全確定結(jié)構(gòu)的紅曲色素有十幾種，其中發(fā)現(xiàn)并確定結(jié)構(gòu)的紅曲黃色素就有六種，如安卡紅曲黃素（Ankaflavin）和紅曲素（Monascin）[3]、Xanthomonasin A和Xanthomonasin B[3]、monascusones A和monascusones B[4]。紅曲黃色素不僅因其很好的耐熱性和耐酸性而廣受食品生產(chǎn)者和研究者的喜愛，同時還具有一定的生物活性，如Monascin及其衍生物對小鼠T細(xì)胞有免疫抑制作用[5]，能減低皮膚癌的出現(xiàn)幾率[6]；ankaflavin通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)的機制對癌細(xì)胞株有選擇性細(xì)胞毒性等[7]，但因菌種的缺乏，有關(guān)紅曲黃色素工業(yè)化生產(chǎn)的研究報道較少[8-10]。

本實驗室通過物理化學(xué)誘變獲得一株高產(chǎn)黃色素的紅曲霉突變菌株（Monascus anka mutant MYM 2）[9]，并對其合成代謝黃色素的特性進行了一定的研究，也證實其合成代謝的黃色素是安卡紅曲黃素（Ankaflavine）和紅曲素（Monascin）[10-13]。這說明紅曲霉突變菌株合成代謝紅曲色素和橘霉素的機理跟其他紅曲霉菌種合成代謝色素和橘霉素的機理基本一樣。在本文中，根據(jù)紅曲色素和橘霉素合成代謝的相關(guān)報道[4，14-17]，來研究表面活性劑吐溫對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響，希望能篩選出一種或幾種能提高黃色素的合成代謝量以及消除橘霉素的合成代謝的化學(xué)物質(zhì)，從而為實現(xiàn)紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅曲霉突變株菌（Monascus anka mutant） 華南理工大學(xué)生化工程研究室選育并保存；吐溫均為Sigma進口分裝；其余化學(xué)試劑均從廣州市化學(xué)試劑廠購買，均為分析純；斜面種培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（麥芽汁由廣東珠江啤酒有限公司提供）；種子培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉30，硝酸鈉3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，磷酸二氫鉀4，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：氯化銨15，可溶性淀粉70，葡萄糖20，玉米漿10，KH2PO45，初始pH 4.0。

2802SUV/VIS型紫外可見光分光光度計上海尤尼科斯科學(xué)儀器有限公司；C25KC型全溫?fù)u床美國New Brunswick Scientific公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ER-180A型電子天平日本A&D公司；Aglient 1100液相色譜美國安捷倫科技有限公司；Scientz IID超聲波細(xì)胞破碎機寧波新芝生物科技股份責(zé)任有限公司。

1.2實驗方法

斜面種在32℃下培養(yǎng)2～3d；種子液在32℃，160r/m in培養(yǎng)2～3d；搖瓶發(fā)酵條件為250m L三角瓶裝30m L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吐溫種類（Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80）和濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2g/L）根據(jù)實驗設(shè)計需要變化，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌接種后160r/m in，32℃下培養(yǎng)7d，所有發(fā)酵實驗均設(shè)計三個平行實驗，計算平均值。

1.2.1胞外色價測定取一定體積的發(fā)酵液，4000r/m in離心20m in，上清液經(jīng)定性濾紙過濾，濾液經(jīng)稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用分光光度計在波長410nm下測定其OD410值，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞外黃色素色價；在波長510nm下測得OD510乘以稀釋倍數(shù)即為胞外紅色素色價，色價單位用U/m L表示。

1.2.2胞內(nèi)色價測定離心后的菌體沉淀用70%乙醇抽提1h，然后4000r/m in離心20m in，上清液過濾，濾液經(jīng)稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，測定其OD410，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)黃色素色價；測得的OD510值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)紅色素色價，色價單位用U/m L表示。

總黃色素色價為胞外黃色素色價與胞內(nèi)黃色素色價之和。

1.2.3細(xì)胞干重（DCW）的測定吸取5m L發(fā)酵液，4000r/min離心20min，除去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌，4000r/m in離心20m in，除去上清液，重復(fù)三次后沉淀于80℃烘箱中烘至恒重。黃色素相對于細(xì)胞干重得率為黃色素色價與細(xì)胞干重的比值。

1.2.4橘霉素的檢測橘霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和測定根據(jù)許贛榮報道的稍作修改[18]。5m L發(fā)酵液用5m L 95%乙醇抽提1h，通過超聲波細(xì)胞破碎機（650W，變幅桿￠8，破碎時間30s，間隔時間30s，總時間5m in）破碎后于4000r/min離心20min，離心上清液通過濾紙過濾，濾液再用0.45μm有機系膜過濾，吸取濾液20μL來進行橘霉素色譜檢測。HPLC檢測條件：Aglient 1100的高效液相，柱為Eclipse XDB reverse C18柱（250mm× 4.6mm，5μm顆粒大?。鶞?8℃，檢測器為紫外檢測器（λ=254nm）；流動相（用色譜純磷酸來調(diào)pH至2.5）為乙腈∶水（35∶65，v∶v），流動相流速為1.0m L/m in。橘霉素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：（稀釋倍數(shù)為100～300），其中為峰面積，為橘霉素濃度（mg/L）。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均為重復(fù)三次的平均值。用Origin 8.0進行作圖，用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1吐溫80對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

從圖1得知，0.5g/L的吐溫80添加量有利于胞內(nèi)黃色素的合成代謝，此時胞內(nèi)黃色素色價為84.04U/m L，比沒添加吐溫80時的發(fā)酵情況高出9.32%，同樣總黃色素的積累量也高出7.76%。再增加吐溫80的添加量時，反倒不利于黃色素的合成代謝。

圖1　吐溫80對紅曲黃色素合成代謝的影響Fig.1　Effectof Tween 80 on Monascus yellow pigments production

從表1得知，吐溫80的添加能明顯消除橘霉素的合成代謝，當(dāng)添加1.2g/L的吐溫80時，發(fā)酵液中檢測不到橘霉素的存在。在一定范圍內(nèi)，添加一定量的吐溫80有利于紅曲霉突變菌株的生長，但影響不明顯。吐溫80對黃色素得率影響不是很大，都維持在3500～4000U/g之間。

表1　吐溫80對紅曲霉菌突變菌株生長和代謝的影響Table 1　Effectof Tween 80 on growth andmetabolism of Monascus anka mutant

有研究表明，添加一定量的Tween 80（0.4%）既不影響培養(yǎng)基中糖的消耗，也不延遲菌的生長，但能明顯的提高紅色素的產(chǎn)物得率（色價/細(xì)胞干重），是未添加時的6～8倍，當(dāng)濃度低于或高于0.4%時，提高程度就不明顯，但是就能明顯影響菌的生長。進一步實驗表明，添加適量的Tween 80并不是增加紅曲菌細(xì)胞膜的通透性來提高色素的分泌能力，而應(yīng)該是通過更復(fù)雜的代謝途徑來影響色素的生成[15]，而本文研究表明吐溫80對黃色素得率影響不明顯。

2.2吐溫20對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

添加一定量吐溫20對胞外黃色素的合成代謝影響不是很明顯，但是對胞內(nèi)黃色素合成代謝的影響比較明顯，從而對總黃色素積累量的影響也比較明顯。當(dāng)吐溫20添加濃度為0.3g/L時，胞內(nèi)黃色素的合成代謝量達到最大，高出沒添加吐溫20發(fā)酵時的11.84U/m L，提高了12.30%，總黃色素色價提高12.49%，但對胞外黃色素合成代謝量影響不明顯（見圖2）。

圖2　吐溫20對紅曲黃色素合成代謝的影響Fig.2　Effectof Tween 20 on Monascus yellow pigments production

從表2中得知，吐溫20的添加能明顯消除了橘霉素的合成代謝，當(dāng)添加0.9g/L的吐溫20時，發(fā)酵液中檢測不到橘霉素的存在。對紅曲霉突變菌株的生長和黃色素得率的影響不明顯（表2）。

表2　吐溫20對紅曲霉菌突變菌株生長和代謝的影響Table 2　Effect of Tween 20 on growth and metabolism of Monascus anka mutant

吐溫20對胞內(nèi)黃色素合成代謝有一定的有利影響，對橘霉素的合成代謝起到一定的消除效果，但是對突變菌株的生長影響不是很明顯（表2）。吐溫20在一定程度上有利于黃色素的合成代謝是因為其作用在黃色素合成代謝途徑上的結(jié)果，而不是促使菌大量生長導(dǎo)致黃色素積累量的增多。吐溫20對橘霉素的消除效果很可能是因為吐溫20在橘霉素合成代謝途徑上起到一定的抑制作用而導(dǎo)致的。

2.3其他表明活性劑對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

還研究了其他一些表面活性劑對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響。結(jié)果表明它們對黃色素的合成代謝有不利影響，同時對橘霉素合成代謝抑制效果不明顯，甚至有促進作用（見表3和表4）。如吐溫60能提高橘霉素含量317.44%，使胞內(nèi)黃色素色價下降15.23%，胞外黃色素色價下降23.81%，總黃色素色價下降14.09%；吐溫40能提高橘霉素含量111.36%，使胞內(nèi)黃色素色價下降8.33%，胞外黃色素色價下降2.56%，總黃色素色價下降6.37%。吐溫60和40吐溫促進橘霉素的合成代謝或許是從代謝途徑上促進橘霉素合成代謝，也許是增大了菌體膜的通透性，從而增加了橘霉素的分泌量。

表3　吐溫60對紅曲霉菌突變菌株生長和代謝的影響Table 3　Effectof Tween 60 on growth and metabolism of Monascus anka mutant

表4　吐溫40對紅曲霉菌突變菌株生長和代謝的影響Table 4　Effectof Tween 40 on growth and metabolism of Monascus anka mutant

3　討論

吐溫是聚合山梨醇結(jié)合不同的脂肪酸后再與不同濃度的環(huán)氧乙烷縮聚而制得，其中吐溫20是結(jié)合月桂酸，吐溫40是結(jié)合棕櫚酸，吐溫60是結(jié)合硬脂酸，吐溫80是結(jié)合油酸。根據(jù)吐溫的HLB值（吐溫80、吐溫60、吐溫40、吐溫20的HLB分別為15、14.9、15.6、16.7）得知，在本文研究中所用的吐溫均為親水性表面活性劑，但吐溫20的親水性最強。其中吐溫80具有很強的破裂細(xì)胞膜的作用而引起刺激性、溶血性和致敏性（組胺釋放）。吐溫20有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。

隨著親水性越強，胞外黃色素色價增加（見圖1和圖2），這說明親水性越強的吐溫有利于胞外色素（水溶性）的生成或分泌，而親水性較差的吐溫（如吐溫80）有利于胞內(nèi)黃色素（脂溶性）的合成代謝。這說明化學(xué)物質(zhì)的親水性強弱對于胞外和胞內(nèi)黃色素的生成量有一定的影響，是影響細(xì)胞膜從而影響了黃色素的分泌或改變黃色素的分子空間結(jié)構(gòu)從而影響黃色素的水溶性或脂溶性或其他原因，這些都還有待進一步的研究。

從細(xì)胞生長量角度而言，本文中所用的吐溫對紅曲霉突變菌株的生長沒有明顯的影響，這說明吐溫促進或減少黃色素的代謝生成量并不是因為微生物菌體的增加或減少造成的（見表1～表4）。吐溫80和吐溫20對黃色素的合成代謝有一定的影響，并且能明顯消除橘霉素的合成代謝（見表1和表2）。以上所有實驗結(jié)果表明，吐溫對紅曲霉突變菌株合成代謝橘霉素和黃色素的影響不能簡單從其理化特征來解釋，在復(fù)雜的培養(yǎng)系統(tǒng)中吐溫的存在對紅曲菌次級代謝產(chǎn)物的合成代謝影響出現(xiàn)迭代性和綜合性，應(yīng)該是從代謝合成途徑以及細(xì)胞膜的通透性方面來影響次級代謝產(chǎn)物的生成及其菌本身的生長。雖然有報道添加適量的Tween 80并不是增加紅曲菌細(xì)胞膜的通透性來提高紅色素的分泌能力，而應(yīng)該是通過更復(fù)雜的代謝途徑來影響紅色素的生成[15]，但是本文作者認(rèn)為目標(biāo)代謝產(chǎn)物及研究對象的不同，吐溫的影響效果不一樣，吐溫對胞外黃色素的分泌應(yīng)該與吐溫的親水性有關(guān)系。不論橘霉素還是黃色素的合成代謝，吐溫對其的影響應(yīng)該是從代謝途徑或分泌途徑上來實施的，而不是因為增加或減少微生物菌體量來影響的。

但是最近有人研究了幾種表面活性劑對紅曲菌種合成代謝色素的影響，發(fā)現(xiàn)除了Triton X-100對色素的合成有明顯影響之外，其他表面活性劑除了吐溫20外，一定濃度的吐溫對色素的合成有一定的促進作用，但影響不明顯[19]。以此進一步研究發(fā)現(xiàn)Triton X-100通過影響紅曲菌細(xì)胞膜脂質(zhì)的不飽和度，有利于色素的分泌，提高胞外色素的得率，且在一定程度上能消除橘霉素的生成[19-22]。但是在本文中為什么吐溫20和80對黃色素的合成代謝有促進作用，對橘霉素的合成代謝有消除效果，而吐溫40和60呈現(xiàn)完全相反的結(jié)果，其原因還有待進一步的研究，如果結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)來研究其橘霉素和色素的代謝機理也許是一個很不錯的選擇。

4　結(jié)論

吐溫20和吐溫80對黃色素的合成代謝有一定的促進作用，對橘霉素的合成代謝有一定的消除效果，但效果不明顯，而吐溫40和吐溫60對橘霉素的合成代謝有明顯的促進影響，對黃色素的合成代謝影響出現(xiàn)不利影響。研究結(jié)果在一定程度上為紅曲黃色素工業(yè)化液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

[1]Blaine A，Pfeifer，Chaitan Khosla.Biosynthesis of polyketide in heterologous hosts[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65（1）：106-118.

[2]David A，Hopwood.Genetic contributions to understanding polyketidesynthesis[J].ChemicalReviews，1997，97（7）：2470-2497.

[3]Yii-Lih Lin，Teng-Hsu Wang，Min-Hsiung Lee，et al. Biologicallyactivecomponentsandnutraceuticalsinthe Monascus-fermented rice：A review[J].ApplMicrobiol Biotechnol，2008，77：965-973.

[4]Jongrungruangchok，Kittakoop SP，Yongsmith B.Azaphilone pigments from a yellow mutant of the fungus Monascus kaoliang [J].JPhytochemistry，2004，65：2569-2575.

[5]Martinkova L，Patakova Juzlova P，Kren V，et al.Biological activities of oligoketide pigments of Monascus purpureus[J].Food Additive Contaminent，1999，16：15-24.

[6]Akihisa T，Tokuda H，Ukiya M，et al.Anti-tumorinitiating effects ofmonascin，an azaphilonoid pigment from the extract of Monascus pilosus fermented rice（red-mold rice）[J].Chem Biodivers，2005，2：1305-1309.

[7]Su NW，Lin YL，Lee MH，et al.Ankaflavin from Monascus fermented red rice exhibits selective cytotoxic effect and induces cell death on Hep G2 cells[J].J Agric Food Chem，2005，53：1949-1954.

[8]Yongsmith B，Krairak S，Bavavoda R.Production of yellow pigments in submerged culture of amutant of Monascus spp[J].J Ferment Bioeng，1994，78：223-228.

[9]周波，王菊芳，吳振強，等.高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J].微生物學(xué)通報，2008，35（12）：1909-1914.

[10]Bo zhou，Jufang Wang，Yuewu Pu，et al.Optimization of culture medium for yellow pigments production with Monascus anka mutant using response surface methodology[J].European Food Research and Technology，2009，228（6）：895-901.

[11]周波，朱明軍，王菊芳，等.銨鹽對紅曲黃色素、紅色素及橘霉素代謝形成的影響[J].重慶工學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，23（1）：46-53.

[12]周波，楊玲，崔思穎，等.響應(yīng)面法提高紅曲黃色素色調(diào)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，36（11）：91-95.

[13]周波，浦躍武，朱明軍，等.氮源對紅曲霉突變菌株產(chǎn)黃色素的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（2）：123-127.

[14]Hassan Hajjaj，PBlanc J.Biosynthetic pathway of citrinin in the filamentous，fungus Monascus ruber as revealed by 13C nuelear magneticresouance[J].AppledandEnvironmental Microbiology，1999（1）：311-314.

[15]Siu-Wai Chiu，Yam-Kau Poon.Submerged production of Monascus pigments[J].Mycologia，1993，85（2）：214-218.

[16]周波，朱明軍，吳振強，等.金屬鹽對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素影響的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（4）：342-347.

[17]Hassan Hajjaj，Alain Klaebe，Gerard Goma，et al.Medium chain fatty acids affect citrinin production in the filamentous fungusMonascusrubber[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2000，66（3）：1120-1125.

[18]Xu Ganrong，Chen Yun，Yu Huiling.HPLC fluorescence method for determination of citrinin from Monascus cultures[J]. Archiv fur Lebensmittelhygiene，2003，4，82-84.

[19]YonghuiWang，Bobo Zhang，Liping Lu，et al.Enhanced production of pigments by addition of surfactants in submerged fermentation of Monascus purpureus H1102[J].JSci Food Agric，2013，93：3339-3344.

[20]Blyu Kang，Xuehong Zhang，Zhenqiang Wu，et al. Solubilization capacity of nonionic surfactantmicelles exhibiting strong influence on export of intracellular pigments in Monascus fermentation[J].Microbial Biotechnology，2013（6）：540-550.

[21]ZhiqiangHu，XuehongZhang，ZhenqiangWu，etal. Perstraction of intracellular pigments by submerged cultivation of Monascus in nonionic surfactant micelle aqueous solution[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2012，94：81-89.

[22]Blyu Kang，Xuehong Zhang，Zhenqiang Wu，et al.Effect of pHand nonionic surfactant on profile of intracellular and extracellular Monascus pigments[J].Process Biochemistry，2013，48（5-6）：759-767.

Effect of Tween on Monascus yellow pigment anabolic

ZHOU Bo1，2，3，TIAN Yuan1，2，3，ZHONG Hai-yan1，2，3
（1.National Engineering Laboratory of Rice and by-products Processing，Changsha 410004，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Grain＆Oil Processing and Quality Control，Changsha 410004，China；3.School of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

Four kinds of Tween had been used to influence on Monascus yellow pigments and citrinin p roduction by Monascus anka mutant and the results showed that intracellular Monascus yellow p igments p roduc tion had been im p roved w ith 12.30%and 9.32%by add ing Tween 20 and Tween 80，respectively，and elim ination for citrinin p roduction，butallwas notobviously.On the contrary，As far as Tween 40 and Tween 60 were concerned，citrinin p roduc tion had been increased w ith 111.36%and 317.44%and intracellular Monascus yellow p igments had been decreased w ith 8.33%and 15.23%by Monascus anka mutant，respectively.The results in this paper could p rovide theoretical exp lanation and technical reference for the monascus yellow pigments submerge p roduction w ith industrialscale.

Tween；citrinin；Monascus yellow pigments；Monascus anka mutant

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.035

2013－11－19

周波（1978-），男，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵。

國家自然科學(xué)基金（31301550）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（14C1185）；中南林業(yè)科技大學(xué)青年科學(xué)基金。