楊瑛

（廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北廊坊065001）

酶電極法快速測定黃原膠中乙醇含量

楊瑛

（廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北廊坊065001）

采用酶電極法對市售黃原膠中乙醇含量進行了測定，同時優(yōu)化了儀器進樣條件及樣品前處理條件。實驗結(jié)果表明，應用酶電極法測定乙醇，該方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.9994；方法的檢出限為0.02%；儀器檢測速度為20s；測得不同濃度下方法的回收率為83.3%～93.3%；精密度實驗的相對標準偏差（RSD）均在3%以下，穩(wěn)定性好。該方法操作簡單，能滿足對黃原膠產(chǎn)品中的乙醇含量的快速檢測。

酶電極法，黃原膠，乙醇，快速檢測

黃原膠是野油菜黃單胞菌以玉米淀粉為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)的一種多糖產(chǎn)品[1-3]，根據(jù)美國藥典中對有機揮發(fā)性雜質(zhì)-溶劑殘留限量的要求，產(chǎn)品中乙醇殘留限量應不得高于0.05%[4]。目前國家標準[5]對黃原膠產(chǎn)品中的乙醇含量還沒有出具相應的標準，這給企業(yè)對黃原膠產(chǎn)品的乙醇控制帶來一定難度。結(jié)合黃原膠產(chǎn)品的粘性，需要開發(fā)出一種便捷的乙醇速測方法，以滿足企業(yè)產(chǎn)品監(jiān)測需要。

痕量乙醇的測定方法主要包括化學氧化法[6]、分光光度法[7]、重鉻酸鉀比色法[8-9]、頂空氣相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12-17]、酶電極法[18-20]等。其中化學氧化法操作過程復雜，且因為儀器和人為因素干擾會使測定結(jié)果與實際值存在一定誤差；分光光度法和重鉻酸鉀比色法受樣品顏色干擾較為嚴重；頂空氣相色譜法和氣相色譜法價格昂貴、操作復雜、大大提高了企業(yè)的檢測成本，故在指導生產(chǎn)的實際應用中受到較大限制。酶電極法對于乙醇的測定，目前有一些相關(guān)報道[18-20]，但對于黃原膠產(chǎn)品中的乙醇檢測還沒有相應的方法的報道。

酶電極法利用了酶催化反應特異性原理，乙醇氧化酶在有氧條件下催化乙醇的氧化反應，生成乙酸和過氧化氫，過氧化氫和過氧化氫電極接觸產(chǎn)生電流（該電流值和乙醇的濃度呈線性比例），在SBA生物傳感器顯示屏上顯示一個數(shù)值，根據(jù)此讀數(shù)值計算可得乙醇質(zhì)量分數(shù)。實驗擬通過優(yōu)化儀器進樣條件以及前處理條件，建立一種快捷、經(jīng)濟、簡單的酶電極速測方法，實現(xiàn)對黃原膠產(chǎn)品中乙醇的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇 色譜純，純度為99.9%，SIGMA-ALORICH公司；乙醇酶膜專用緩沖劑 山東省科學院生物研究所，一袋可配制500m L緩沖溶液，純度為99.9%；緩沖溶液 將一袋乙醇酶膜專用緩沖劑充分溶解于水中，后轉(zhuǎn)移定容至500m L容量瓶中，搖勻，過0.25μm水系濾膜，pH7.2±0.1；黃原膠 市售；分析用水 符合GB/T 6682規(guī)定的一級水規(guī)格。

SBA生物傳感器 內(nèi)置檢測信號轉(zhuǎn)換裝置，山東省科學院生物研究所；乙醇氧化酶膜 山東省科學院生物研究所，應在0～4℃條件下保存，有效期1年；XS204電子天平（0.1mg） 瑞士梅特勒公司；電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 乙醇標準溶液的配制

吸取30μL乙醇于10m L容量瓶中，用蒸餾水準確

定容至刻度，搖勻，之后吸取上述溶液1m L于25m L容量瓶中，用蒸餾水準確定容至刻度，搖勻，作為定標液。

1.3 樣品預處理

移取100m L超純水于250m L燒杯中，加入攪拌子后緩緩開啟攪拌，稱取0.5g（精確至0.001g）黃原膠樣品，將其緩慢的加入，之后將整個燒杯口用保鮮膜進行密封，將速率檔調(diào)至中部（約800r/min），在攪拌臺上攪拌0.5h，待攪拌均勻后可直接取樣進行測定。

1.4 測定條件

1.4.1 酶膜安裝以及激活 在SBA生物傳感器配備的過氧化氫電極上安裝乙醇酶膜，之后用乙醇酶膜特定緩沖劑對整個體系進行緩沖清洗，開機激活酶膜，等待2h之后進行測定。每次開機儀器會自動清洗一次，進樣燈（綠燈）亮并閃動，當屏幕處于自動零狀態(tài)的0值時，把吸取好的25μL 0.1g/L的乙醇標準溶液注入進樣口。反應結(jié)束后，儀器自動開始定標，屏幕顯示設(shè)定的標值為200，并自動清洗反應池，反復測定乙醇標準溶液，當儀器穩(wěn)定后，即前后兩針的結(jié)果相對誤差小于1%時，儀器便自動定好標，標志是進樣燈（綠燈）一直亮但不閃動。

1.4.2 定量分析 定標完成后對不同濃度標準溶液進樣做標準曲線，首先對乙醇標準溶液進行逐級稀釋，將其配制成0.001、0.002、0.003、0.006、0.013、0.025、0.050、0.100g/L的乙醇系列標準稀釋液，對上述標準稀釋液進樣，得到生物傳感器面板上相對應的顯示值，此時以顯示值對乙醇濃度作圖，擬合標準曲線，得到其線性方程，確保標準曲線系數(shù)R2≥0.99。

用預先處理好的試液清洗微量進樣器，至少三次。準確吸取25μL試液，用濾紙擦干針尖外部，注入進樣口，20s后讀取顯示值。同一樣品進樣測定三次，將測定值帶入線性方程計算試液中的乙醇質(zhì)量分數(shù)。為了確保實驗數(shù)據(jù)的準確性，測定過程中需保證生物傳感器只開啟單側(cè)的響應開關(guān)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)由以下公式進行計算：

式中：Y為黃原膠樣品中乙醇的檢出量，%；C為由線性回歸方程計算出的樣品中乙醇的質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品加水體積，100m L；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1.1 樣品稱樣量優(yōu)化 由于黃原膠樣品本身具有一定的粘性，前處理過程中首先要確定其稱樣量以及加水體積，對不同稱樣量黃原膠樣品處理后進行檢測比對，比對數(shù)據(jù)見表1。

樣品稱樣量的選取原則，主要是保證樣品稱樣量足夠大，以確保痕量乙醇檢測的準確性；加水體積的選取，一方面是考慮加入足夠量的水能夠使樣品充分溶解并且攪拌均勻，另一方面是保證攪拌完成之后能夠用生物傳感儀自帶的50μL進樣針吸取后進樣。表1中首先嘗試了0.5g的稱樣量，加水50m L攪拌后測定，由于加水量少導致黃原膠粘度過大，無法用進樣針吸取進樣。后嘗試加水100m L以及200m L攪拌進樣，檢測情況良好，但加入200m L水導致樣品攪拌后過稀，會影響檢測的穩(wěn)定性及準確性。參考了0.5g稱樣量、100m L的加水規(guī)格，以相同的稀釋倍數(shù)選擇稱取了1、2g的黃原膠樣品攪拌測定，從表1數(shù)據(jù)可知測得乙醇質(zhì)量分數(shù)穩(wěn)定性良好。鑒于0.5g的稱樣量能夠滿足檢測需求，考慮到檢測的經(jīng)濟性，確定稱取0.5g樣品，加水100m L做為樣品最終稱樣條件。

表1 樣品稱樣量優(yōu)化實驗Table 1 The optimization experiment forweightmeasurement of sample

2.1.1.2 樣品攪拌時間優(yōu)化 樣品測定中需要在一定速率下進行攪拌，稱取黃原膠0.5g，加水100m L，對其攪拌時間的比對實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 樣品攪拌時間優(yōu)化實驗Table 2 The optimization experiment formixing time of sample

從表2可知，樣品攪拌0.5h后測得黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)趨于穩(wěn)定，說明樣品攪拌0.5h即可攪拌均勻，此優(yōu)化條件極大的縮短了批量測定中的前處理時間，方便了測定。

2.1.2 儀器條件優(yōu)化 本實驗經(jīng)過前期的文獻查閱，對于生物傳感器進樣反應時間以及清洗時間進行了優(yōu)化，生物傳感器廠家推薦最短清洗時間為25s。

稱取黃原膠0.5024g，加水100m L，對反應時間從5s開始進行了考察，優(yōu)化實驗比對結(jié)果見表3。

表3 儀器條件優(yōu)化實驗Table 3 The optimization experiment for instrument condition

由表3可知，儀器反應20s之后再延長儀器反應時間，在清洗時間40s之后，黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)趨于穩(wěn)定。在廠家推薦清洗時間為25s的條件下，測得乙醇質(zhì)量分數(shù)較低，繼續(xù)延長清洗時間為40s乃至更長，此時黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)趨于穩(wěn)定。分析原因為，廠家推薦清洗時間是針對非粘性的溶液，但黃原膠樣品粘性大，25s的清洗時間并不能徹底清洗反應腔，可能會有一定黃原膠殘留。但生物傳感儀中反應腔的體積是固定的，黃原膠的殘留會導致樣品進樣量降低，從而導致乙醇質(zhì)量分數(shù)偏低。綜合以上數(shù)據(jù)可知，儀器反應為20s，清洗時間為40s，即可將單個反應進行完全，整個測定時間控制在1m in。每個樣品重復測定3次取平均值，進而可計算黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)，進樣10針后需要進行1次定標。

2.2 線性回歸方程與方法定量限

在優(yōu)化條件下，考察了乙醇標液的線性范圍，以乙醇標準溶液濃度為橫坐標，以生物傳感器面板上相對應的顯示值測定三次的平均值為縱坐標作圖。結(jié)果顯示，乙醇標準溶液在0.003～0.1g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9994，同時計算了方法的最低檢出限（S/N=3）為0.02%，方法的定量限（S/N=10）為0.07%。線性標準曲線見圖1。

圖1 乙醇線性標準曲線Fig.1 The linear standard curve of ethyl alcohol

2.3 方法的回收率

按照標品濃度為1、2、5倍定量限的原則，在黃原膠樣品中添加三個不同濃度的乙醇標液，測得不同添加濃度下的回收率在83.3%～93.3%之間，結(jié)果見表4，說明前處理過程中損失或沾污較少，樣品前處理方法可靠。

表4 加標回收實驗Table 4 Recovery experimentof themeasured results

2.4 方法的精密度與相對標準偏差

采用本方法測定了兩批黃原膠樣品中乙醇質(zhì)量分數(shù)，平行測定5次，同時計算其標準偏差以及相對標準偏差，結(jié)果見表5。表5數(shù)據(jù)顯示兩批樣品的乙醇質(zhì)量分數(shù)平行性較好，其標準偏差均為0.01%，相對標準偏差分別為2.74%和2.32%。

表5 精密度實驗Table 5 Precision experimentof themeasured results

2.5 方法的穩(wěn)定性

采用本方法對同一批樣品在不同天數(shù)的酶電極法測定情況進行了考察，平行測定5次，取平均值，結(jié)果見表6。從結(jié)果可知，7d測定的乙醇質(zhì)量分數(shù)均較穩(wěn)定，說明此方法對樣品測定的穩(wěn)定性較好。

2.6 方法的重現(xiàn)性

將同一黃原膠樣品放置30、60d之后采用本方法對乙醇測定情況進行了考察，每個樣品測定5次，取平均值，結(jié)果見表7。從結(jié)果可知，測定的乙醇質(zhì)量分數(shù)平均值為0.42%，說明此方法對同一樣品在放置一段時間之后測定的條件下重現(xiàn)性較好。

2.7 與氣相色譜法的比對

應用FCCV[21]中黃原膠產(chǎn)品揮發(fā)性氣體檢測方法蒸餾提取-氣相色譜法對黃原膠中的乙醇質(zhì)量分數(shù)進行檢測，此方法以叔丁醇作為內(nèi)標物，配制乙醇標

準曲線；前處理對樣品進行蒸餾，蒸餾環(huán)節(jié)稱取0.5g樣品后加入300m L的水，邊攪拌邊加熱蒸餾提取1h，之后往蒸餾瓶中加入4m L叔丁醇進行乙醇提?。贿M樣環(huán)節(jié)設(shè)定進樣口及檢測器溫度為200℃，柱溫為165℃，取樣0.5μL進行檢測分析。同時用酶電極法檢測，同一樣品測定三次，兩方法比對發(fā)現(xiàn)結(jié)果并沒有顯著性差異，結(jié)果見表8。

表6 穩(wěn)定性實驗Table 6 Stability of themeasured results

表7 重現(xiàn)性實驗Table 7 Reproducibility experimentof themeasured results

表8 同氣相色譜法比對結(jié)果Table 8 Result comparison with gas chromatography

蒸餾提取-氣相色譜法操作復雜，檢測所用的色譜柱昂貴，前處理以及上機檢測時間長，檢測成本高。相對而言，酶電極法前處理簡單，上機檢測時間短，所需的耗材為乙醇酶膜，價格比較便宜，此檢測方法優(yōu)勢顯著。

3 結(jié)論

本實驗實現(xiàn)了酶電極法對黃原膠產(chǎn)品中的乙醇的快速檢測。本實驗同時優(yōu)化了儀器的進樣條件和樣品的前處理條件，實現(xiàn)了樣品檢測的及時性，取得了較好的檢測結(jié)果。結(jié)果顯示：乙醇標準溶液線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為0.9994，方法檢出限為0.02%；在黃原膠產(chǎn)品中添加一定量的乙醇標準溶液后，測得其不同濃度下的添加回收率在83.3%～93.3%之間，其精密度實驗平行測定5次得到的相對標準偏差（RSD）均在3%以下，以上數(shù)據(jù)均說明方法的可行性較高。此方法可作為一種較低成本的檢測方法在企業(yè)中進行推廣應用，且前處理簡單、快速、回收率高、精密度好，由于乙醇酶膜本身的特異性響應，雜質(zhì)的存在不會影響乙醇的定量分析，極大的保證了檢測的準確性。酶電極法作為測定黃原膠產(chǎn)品中乙醇的一種簡單快速的生物傳感儀速測方法，對于企業(yè)具有較高的實際應用價值。

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Rapid determination for ethyl alcohol in xanthan gum byenzyme electrode

YANG Ying
（Meihua BioTech（Langfang）Co.，Ltd.，Langfang 065001，China）

The ethyl alcohol in xanthan gum was determined by enzyme electrode，the instrument conditions andthe pre-treatment conditions were further optimized. The results showed that this method had excellent linearrelationship with the correlation coefficient of 0.9994 and the detection limit of the method was 0.02% . Thedetection rate of instrument was 20s. The recovery rates were 83.3%～93.3% and the relative standard deviationwere all below 3%. This developed method was easy，sensitive and reliable，which could be used to analyzeethyl alcohol in xanthan gum.

enzyme electrode；xanthan gum；ethyl alcohol；rapid detection

TS207.3

：A

：1002-0306（2014）16-0082-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.009

2013－11－20

楊瑛（1987-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全。