張春芝，莫寅斌

（寧夏防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川750199）

寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄酵母菌初步分類鑒定及多樣性研究

張春芝，莫寅斌

（寧夏防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川750199）

通過對(duì)從寧夏產(chǎn)區(qū)的葡萄園土壤、葡萄果實(shí)表皮以及葡萄酒發(fā)酵過程中獲得的729株野生酵母菌株進(jìn)行初步分離、形態(tài)學(xué)鑒定，并運(yùn)用顯微鏡攝像技術(shù)和利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)酵母菌進(jìn)行聚類分析，最終確定為16個(gè)酵母類型。進(jìn)而確定寧夏產(chǎn)區(qū)的葡萄酒相關(guān)酵母菌的生物多樣性，為地方特色葡萄酒酵母菌的篩選和選育提供理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

葡萄酒；酵母菌；分類鑒定；多樣性

寧夏賀蘭山東麓地區(qū)已經(jīng)成為國際國內(nèi)公認(rèn)的最適宜種植優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的“黃金地帶”，在全國釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)中具有非常重要的地位[1]。葡萄酒釀造是一個(gè)復(fù)雜的微生物學(xué)過程，其中酵母菌是最重要的微生物菌群。酵母性能的好壞對(duì)葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量、經(jīng)濟(jì)性、生產(chǎn)管理均有較大影響，還對(duì)葡萄酒產(chǎn)品特色和風(fēng)格的形成至關(guān)重要[2-3]。釀造具有地域特色的葡萄酒將成為關(guān)注的焦點(diǎn)，本土菌種的選育與發(fā)酵生產(chǎn)或者與其他菌種混合進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)具有地區(qū)特色的葡萄酒成為葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢[4-7]。

在傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，酵母菌由于逐漸適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、土壤和葡萄品種，以及自然選擇的作用，形成了適合當(dāng)?shù)仄咸丫频奶赜械奶烊粌?yōu)良酵母菌株，具有很強(qiáng)的地域特性，有助于釀酒師釀造出風(fēng)味復(fù)雜而又有品種典型性的獨(dú)特的葡萄酒[8-14]。通過顯微鏡攝像技術(shù)和利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)寧夏產(chǎn)區(qū)的729株野生酵母菌株進(jìn)行初步分類、鑒定和聚類分析，旨在確定寧夏產(chǎn)區(qū)的葡萄酒相關(guān)酵母菌的生物多樣性，為篩選和選育具有地方特色葡萄酒酵母菌提供理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年9月，分別從寧夏產(chǎn)區(qū)的青銅峽、玉泉營、大武口、西夏區(qū)四個(gè)地區(qū)的葡萄園中采集土壤樣本和成熟度好的釀酒葡萄果粒，運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后，立即分離酵母菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母菌的分離和保存采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20 min（為除去細(xì)菌干擾，加100 mg/L氯霉素）。

初步形態(tài)分類采用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%，pH值為6.0～6.5，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

XTL-340Z正置金相顯微鏡：上海立光精密儀器有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

土樣中酵母菌株的分離：準(zhǔn)確稱取10 g土樣（多點(diǎn)采樣，然后混合）于100 mL 0.1%的蛋白胨水中（提前滅菌），充分振蕩混勻，然后進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋度涂平板，于28℃培養(yǎng)3 d后結(jié)合菌落顏色和形態(tài)選取10～15個(gè)菌落保藏。

葡萄漿果表面酵母菌株的分離：在葡萄成熟季，無菌稱量約10 g成熟葡萄，加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min，制成菌懸液，準(zhǔn)確吸取50 μL涂布于固體YEPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落再劃線純化的方法從中分離純的酵母菌株。

發(fā)酵過程中酵母菌株的分離：在葡萄成熟季，采集葡萄漿果手工破碎后，取葡萄汁（帶部分皮渣）置于200 mL三角瓶中，進(jìn)行自然發(fā)酵。分別于發(fā)酵前期（即玻璃瓶底部產(chǎn)生少量氣泡）、中期（發(fā)酵旺盛，產(chǎn)生大量氣泡，皮渣在頂部形成“帽”）、后期（即液面降低，發(fā)酵醪液中無明顯氣泡上升）取樣，采用稀釋涂布，挑取單菌落再劃線純化的方法從中分離純的酵母菌株。

1.3.2 菌種的保藏

將純化的菌株在YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，活化的菌液與30%的無菌甘油以體積比為1∶1混合于1.5 mL離心管中，-20℃條件下保藏。

1.3.3 菌株的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基聚類分析

將保藏的酵母菌株用液體YEPD培養(yǎng)基活化后，劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～7 d后照相，觀察記錄菌落的顏色和形態(tài)，并根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)進(jìn)行聚類。

1.3.4 顯微鏡照相觀察

選取有代表性的菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中活化，在28℃下培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下觀察其個(gè)體形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落特征、個(gè)體顯微特征及形態(tài)分類結(jié)果

在寧夏葡萄酒產(chǎn)區(qū)分別從土壤、果皮、自然發(fā)酵過程分離得到729株野生酵母菌株，其在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d所形成的菌落顏色和形態(tài)以及在顯微鏡下的個(gè)體特征見圖1，對(duì)照《酵母菌特征與鑒定手冊》[3]，初步分類鑒定為16個(gè)酵母菌類型，見表1。

圖1 寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落特征以及個(gè)體顯微特征Fig.1 Wine-related Yeast colony characteristics on WL Nutrient Medium and microscopic characteristics from ningxia regions

表1 寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)分類結(jié)果[15,16]Table 1 Wine-related yeast morphological classification on WL nutrient medium from Ningxia region

2.2 不同地區(qū)釀酒葡萄園土壤和果實(shí)表皮上的酵母菌種類

不同地區(qū)釀酒葡萄園土壤中的酵母菌種類及分布情況見圖2。由圖2可知，青銅峽、大武口、西夏區(qū)三地的葡萄園土壤中共分離到酵母菌38株，青銅峽、大武口兩地酵母菌數(shù)量較多，類型豐富，均能分離到五種類型，分別是是假絲酵母（Candida species）、葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）以及沒有提及的類型Ⅱ、類型Ⅴ；而西夏區(qū)僅分離到葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和類型Ⅴ。

圖2 不同地區(qū)釀酒葡萄園土壤中的酵母菌種類及分布情況Fig.2 Species and distribution of yeast isolated from soil sample of different vineyards

圖3 不同地區(qū)釀酒葡萄果實(shí)表皮的酵母菌種類及分布情況Fig.3 Species and distribution of yeast isolated from grape skin of different regions

由圖3可知，青銅峽、大武口、西夏區(qū)三地釀酒葡萄果實(shí)表皮共分離得到酵母菌106株，主要是萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、紅酵母（Rhodutorula）以及沒有提及的類型Ⅱ、類型Ⅴ。大隱球酵母（Cryptococcus magnus）僅在大武口的葡萄表皮上分離出來。從總體數(shù)量看，大武口地區(qū)的酵母菌類型最為豐富，青銅峽次之，西夏區(qū)類型最少；可能與西夏區(qū)葡萄園建園時(shí)間短，葡萄樹齡小以及土壤呈砂石結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3 不同釀酒葡萄品種果實(shí)表皮上的酵母菌種類

圖4 不同釀酒葡萄品種果實(shí)表皮的酵母菌種類及分布情況Fig.4 Species and distribution of yeast isolated from grape skin of different varieties

由圖4可知，5個(gè)不同釀酒葡萄品種的果實(shí)表皮酵母菌在類型和數(shù)量均存在較大差異。在分離得到酵母菌106株中，主要是萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、紅酵母（Rhodutorula）以及沒有提及的類型Ⅱ、類型Ⅴ。從品種上看，赤霞珠果實(shí)表皮酵母菌數(shù)量最多，其次是西拉，再者是霞多麗和蛇龍珠，數(shù)量最少的是黑比諾，只有全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）一種。而東方伊薩酵母（Issatchenkia orientali）僅在霞多麗上發(fā)現(xiàn)。

2.4 釀酒葡萄自然發(fā)酵過程中的酵母菌種類

圖5 青銅峽地區(qū)釀酒葡萄自然發(fā)酵過程分離的酵母菌種類及分布情況Fig.5 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Qingtongxia area

由圖5可知，赤霞珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期的酵母菌主要由葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴爾有孢圓酵母（T orulaspora delbrueckii）、紅酵母（Rhodutorula）以及未提及的類型V構(gòu)成，而且以類型V酵母菌為優(yōu)勢菌種。發(fā)酵中期又新增克魯維畢赤氏酵母（Pichia kluyveri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大隱球酵母（Cryptococcus magnus）三種，而且以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和類型V酵母菌在發(fā)酵中期和發(fā)酵后期成為主要的菌種。西拉在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和類型V酵母菌構(gòu)成，中期新增葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、假絲酵母（Candida species）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大隱球酵母（Cryptococcus magnus）四種酵母菌，而且葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主要優(yōu)勢菌種，發(fā)酵后期僅剩下釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖6 大武口地區(qū)釀酒葡萄自然發(fā)酵過程分離的酵母菌種類及分布情況Fig.6 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Dawukou area

由圖6可知，赤霞珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期的酵母菌主要由葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、紅酵母（Rhodutorula）以及未提及的類型V、類型Ⅱ構(gòu)成，而且以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和類型Ⅱ酵母菌為優(yōu)勢菌種。發(fā)酵中期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cere visiae）為主。發(fā)酵后期僅剩下釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。西拉在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期則主要以葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和大隱球酵母（Cryptococcus magnus）為主，中期則以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisi ae）和未提及的類型V為主。后期僅剩下釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。蛇龍珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期則主要以葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）為主，中期則新增粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等菌種，而且以未提及的類型V為主體菌種。后期也只剩下釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖7 玉泉營地區(qū)釀酒葡萄自然發(fā)酵過程分離的酵母菌種類及分布情況Fig.7 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Yuquanying area

由圖7可知，赤霞珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期的酵母菌主要有未提及的類型V和類型Ⅱ?yàn)橹饕N；發(fā)酵中期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主；后期以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和未提及的類型V和類型Ⅱ?yàn)橹饕N。蛇龍珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期則以假絲酵母（Candida species）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和類型V酵母菌為主，中期、后期分別以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主。品麗珠自然發(fā)酵過程中，酵母菌分布規(guī)律與蛇龍珠非常相似。

由圖8可知，赤霞珠在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期以葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）和類型V為主；發(fā)酵中期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和類型V為主；后期則以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主。黑比諾在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期只有葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）三種酵母菌；中期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和類型Ⅱ?yàn)橹?；后期則以葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主。霞多麗在自然發(fā)酵過程中，前期以葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）和全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）為主要菌種；中期則以葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）和紅酵母（Rhodutorula）為主；后期以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和類型V為主。

圖8 西夏地區(qū)釀酒葡萄自然發(fā)酵過程分離的酵母菌種類及分布情況Fig.8 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Xixia area

3 結(jié)論

對(duì)從寧夏產(chǎn)區(qū)分離得到的729株葡萄酒相關(guān)酵母，經(jīng)WL培養(yǎng)基進(jìn)行聚類分析，最終確定為16種類型（其中類型V和類型Ⅱ無法經(jīng)過形態(tài)學(xué)確認(rèn)酵母菌種屬），進(jìn)而確定了寧夏產(chǎn)區(qū)葡萄酒酵母菌群具有多樣性。

土壤和葡萄果實(shí)表皮上的酵母菌類型和數(shù)量因采集地點(diǎn)不同存在較大的差異，這與葡萄園土壤類型、土壤結(jié)構(gòu)、葡萄樹齡、品種等因素有關(guān)，即與葡萄園長期形成的微生物群體生態(tài)密切相關(guān)。釀酒葡萄品種成為酵母菌差異顯著化的主要因素。

在葡萄果皮和自然發(fā)酵前期未分離到釀酒酵母菌，可知在葡萄果皮上不存在釀酒酵母菌。在不同葡萄品種的自然發(fā)酵過程中，均呈現(xiàn)出發(fā)酵前期酵母菌類型約3～4種，數(shù)量較少，而且非酵母菌屬的酵母菌類型V和類型Ⅱ酵母菌參與啟動(dòng)了發(fā)酵；發(fā)酵中期其類型很豐富，一般會(huì)新增3～4種類型；發(fā)酵后期多數(shù)以釀酒酵母為主要菌種，而且屬于能夠適應(yīng)耐酒精能力更強(qiáng)及在高糖環(huán)境中更具競爭力的酵母菌屬釀酒酵母菌。

西夏區(qū)的各品種自然發(fā)酵前期均分離得到全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima），在中、后期則分離不到該菌種。

今后開展本土化釀酒酵母菌群研究的方向，可以重點(diǎn)對(duì)葡萄酒發(fā)酵后期分離得到的釀酒酵母（Saccharomyccs cerevisiac）菌株進(jìn)一步改良，并對(duì)其釀酒性能和釀成的葡萄酒產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行深入研究，從而選育具有地區(qū)特色的葡萄酒釀酒酵母，更好地服務(wù)于葡萄酒產(chǎn)業(yè)。

了解產(chǎn)區(qū)釀酒酵母來源以及葡萄漿果發(fā)酵過程中各酵母的動(dòng)態(tài)變化對(duì)葡萄酒的釀造具有重要的意義。本研究已經(jīng)為生產(chǎn)具有賀蘭山東麓地域特色的葡萄酒而分離篩選本土化酵母菌進(jìn)行了初步探索和實(shí)踐。這對(duì)寧夏產(chǎn)區(qū)葡萄酒發(fā)酵工藝的控制以及優(yōu)良酵母的篩選和優(yōu)化具有一定的意義，也為該地區(qū)酵母資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Classification,identification and diversity of wine-related yeast from Ningxia regions

ZHANG Chunzhi,MO Yinbin
(Ningxia Institute of Prevention and Control of Desertification,Yinchuan 750199,China)

In this study,729 wild yeast strains from soil,grape skins and wine fermentation process in Ningxia regions were isolated and identified. Microscope camera technique and WL nutrient medium was used to conduct clustering analysis on these strains.After morphological observations, these strains were determined as 16 yeast types.Then the diversity of wine-related yeast in Ningxia regions was determined,to provide theoretical basis and research foundation of screening and ascertain Ningxia characteristic wine yeast.

wine;yeast;classification and identification;diversity

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0049-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.012

2014-07-16

寧夏高?？蒲许?xiàng)目（NGY2012146）

張春芝（1977-），女，講師，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>