，，

（1.長沙市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410013；2.長沙市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410013）

一起雞傳染性鼻炎疫情的病原鑒定

王洪亮1，2，顏克旭2，王輝2

（1.長沙市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410013；2.長沙市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410013）

雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌引起雞的急性呼吸系統(tǒng)疾病。主要癥狀為鼻腔與竇發(fā)炎，流鼻涕，臉部腫脹和打噴嚏。其傳播途徑主要以飛沫及塵埃經(jīng)呼吸傳染，但也可通過污染的飼料和飲水經(jīng)消化道傳染。本文對一存欄量達(dá)2萬羽的規(guī)模雞場發(fā)生傳染性鼻炎進(jìn)行了臨床觀察、細(xì)菌分離鑒定以及病例復(fù)制，最后就該雞場傳染性鼻炎的發(fā)生及防控進(jìn)行了分析。

雞傳染性鼻炎；病原；鑒定；分析；PCR

1 材料與方法

1.1 病料及實驗用雞

來自湖南某雞場的10只發(fā)病雞。病例復(fù)制用實驗雞4只，購自湖南某未進(jìn)行過傳染性鼻炎疫苗接種且未出現(xiàn)過傳染性鼻炎疫情的雞場。

1.2 主要試劑

Taq plus DNA polymerase購自北京天根生化科技有限公司，dNTP、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物科技有限公司，巧克力培養(yǎng)基購自鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限公司。

1.3 發(fā)病雞的臨床以及解剖觀察

將送檢病雞進(jìn)行臨床表現(xiàn)觀察后，按常規(guī)方法處死，并進(jìn)行解剖、觀察、采樣。

1.4 細(xì)菌分離以及顯微鏡檢查

從采集的病雞鼻腔、脾臟、肺臟、腎臟無菌鉤取樣本，分別劃線接種巧克力培養(yǎng)基后放于燭缸進(jìn)行培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h后觀察細(xì)菌生長情況。細(xì)菌分離培養(yǎng)操作完成后取鼻腔液、脾臟、肺臟、腎臟、觸片，用姬姆薩染色鏡檢。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)物的鏡檢及PCR鑒定

挑取形態(tài)上具有代表性的單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢和16sR DNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行，引物資料見文獻(xiàn)[1]，PCR方法按常規(guī)操作，并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.6 分離細(xì)菌的藥物敏感性檢測

取分離的可疑病原菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，用紙片法進(jìn)行藥物敏感性檢測。

1.7 病例復(fù)制

取擴(kuò)大培養(yǎng)的可疑病原細(xì)菌，滴鼻接種100日齡左右的三黃雞2只作為試驗組，另飼養(yǎng)2只作為對照組。試驗組于購進(jìn)后第3天每只雞滴鼻2.3×108個細(xì)菌，對照組隔離飼養(yǎng)并同步滴鼻生理鹽水處理。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病雞的臨床和解剖觀察結(jié)果

通過臨床觀察發(fā)病雞，可見病雞有甩頭現(xiàn)象，多數(shù)表現(xiàn)一側(cè)眼睛腫大失明，有1只雞雙側(cè)眼睛失明以及面部腫大（見圖1），其他未見到有異常表現(xiàn)。按常規(guī)方法將病雞處死，解剖發(fā)現(xiàn)，心、肝、脾、肺臟、氣囊、腎臟以及嗉囊、腺胃、肌胃、腸道等均沒有明顯病變，但病雞鼻腔充滿濃稠的粘液（見圖2），1只雞面部皮下有水腫。

圖1病雞眼睛失明面部腫大

圖2病雞鼻腔濃稠的粘液

2.2 細(xì)菌顯微鏡檢結(jié)果

從采集的病雞鼻腔、脾臟、肺臟、腎臟無菌鉤取樣本，接種巧克力培養(yǎng)基，結(jié)果僅在鼻腔粘液接種的平板上長出了2種形態(tài)的細(xì)菌（見圖3）。取病雞心血、肝、脾、肺臟、鼻咽部粘液觸片鏡檢，結(jié)果心血、肝、脾、肺臟觸片沒有觀察到細(xì)菌，但在鼻咽部粘液見到聊桿狀細(xì)菌存在（見圖4）。

圖3鼻腔液細(xì)菌生長情況

圖4鼻腔液觸片鏡檢結(jié)果

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)物顯微鏡檢結(jié)果及PCR擴(kuò)增測序結(jié)果

挑取形態(tài)上具有代表性的單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)平皿表面白色大菌落為革蘭陽性球菌，根據(jù)形態(tài)觀察確定為葡萄球菌。平皿表面大量的小菌落鏡鏡檢為革蘭陰性的小桿菌，最后取小菌落進(jìn)行16sR DNA的PCR擴(kuò)增、測序，測出序列按菌株命名為2LY（序列GeneBank登錄號為KF530284）以及序列的同源性比較分析（見圖5），發(fā)現(xiàn)小菌落16sR DNA與GeneBank登錄的副雞嗜血桿菌同源性最高，與其中登錄號GU951543的副雞嗜血桿菌同源性達(dá)到99.4%。

圖5分離菌16sR DNA與GeneBank登錄序列同源性比較結(jié)果（2LY為分離菌序列）

2.4 藥物敏感性檢測結(jié)果

取分離的副雞嗜血桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，用紙片法進(jìn)行藥物敏感性檢測，結(jié)果見表1，由表1可見該分離菌對頭孢噻吩、氯霉素、環(huán)丙氟哌酸、以及卡拉霉素敏感，但對鏈霉素、強(qiáng)力霉素、以及青霉素不敏感。

表1 各組發(fā)病率與死淘率

2.5 病例復(fù)制結(jié)果

取擴(kuò)大培養(yǎng)的副雞嗜血桿菌，滴鼻接種100日齡左右的三黃雞，結(jié)果實驗組在滴鼻后4天表現(xiàn)出有甩頭、尖叫癥狀，第6天表現(xiàn)出張口呼吸現(xiàn)象（見圖6），第8天試驗組中1只發(fā)病雞出現(xiàn)死亡，另1只雞于發(fā)病后10天自愈，臨床癥狀消失；對照組沒有任何異常表現(xiàn)。取死亡的試驗雞，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，從病雞鼻腔深部分離到了大量的副雞嗜血桿菌。

圖6呈張口呼吸的試驗雞

3 小結(jié)

本文從發(fā)病雞分離到2種形態(tài)的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、PCR測序鑒定將2種細(xì)菌分別鑒定為葡萄球菌和副雞嗜血桿菌。最后通過可疑病原菌的動物回歸試驗證明副雞嗜血桿菌為該次雞群發(fā)病的病原菌，并通過藥敏試驗對分離的副雞嗜血桿菌的藥物敏感性進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)該分離菌株對頭孢噻吩、氯霉素、環(huán)丙氟哌酸藥物非常敏感。雞場通過選用敏感藥物有效的控制了疫情，為雞傳染性鼻炎的診斷以及防控提供了參考[2-3]。

雞傳染性鼻炎的發(fā)生與一些能使機(jī)體抵抗力下降的誘因密切有關(guān)[4]。如雞群擁擠，不同年齡的雞混群飼養(yǎng)，通風(fēng)不良，雞舍內(nèi)悶熱，氨氣濃度大，或雞舍寒冷潮濕，缺乏維生素A，受寄生蟲侵襲等都能促使雞群嚴(yán)重發(fā)病[5]。該雞場雞群采取分層飼養(yǎng)的方式進(jìn)行，雞舍內(nèi)雞群整體密度較大，加上7月份天氣炎熱，所以雞群表現(xiàn)出了明顯的臨床發(fā)病癥狀。

[1] Run C L， Chao T X， Xing Q， et al. Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Masked Palm Civet （Paguma larvata） Journal of Animal and Veterinary Advances， 2012，11（12）：2020-2023.

[2] 朱子潔，汪春雪，梁武. 雞傳染性鼻炎的綜合防制[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010，32（12）：21-23.

[3] 錢鳳芹，莊文忠，任紅梅，等.雞傳染性鼻炎及其防制[J].中國動物保健，2001，30（4）：27-29.

[4] 苗得園，孫惠玲，陳曉峰，等.副雞嗜血桿菌的分離鑒定及我國雞傳染性鼻炎的流行狀況分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，29（4）：31-35.

[5] 陳寶利，郭伶.雞傳染性鼻炎的血清型調(diào)查及鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，37（1）：41-43.

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