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（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

TaqMan實時熒光RT-PCR檢測豬腦心肌炎病毒方法的建立與應(yīng)用

張強，王巧全，熊煒，李樹清，李健，林穎崢，黃忠榮

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

針對豬腦心肌炎病毒（EMCV）基因組保守區(qū)域，設(shè)計并合成了特異性引物和TaqMan探針，建立了EMCV的TaqMan 實時熒光定量 RT-PCR方法。通過常規(guī)RT-PCR方法擴增EMCV保守序列并將其連入pMD19-T載體，制備陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，優(yōu)化反應(yīng)條件，以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，EMCV標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999。結(jié)果顯示，該方法檢測靈敏度達(dá)到10拷貝/μL，對豬捷申病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙型腦炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒檢測結(jié)果均為陰性。方法重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%。檢測采集自上海供港豬場、進境美國種豬、加拿大、法國種豬的血清樣本145份，EMCV核酸的檢出率國內(nèi)豬場53.6%，美國豬檢出率為27.6%，加拿大豬檢出率為20%，法國豬檢出率為26.7%。EMCV實時熒光RT-PCR方法的建立為該病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。

豬腦心肌炎病毒；實時熒光 PCR；TaqMan探針

腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）是一種重要的共患病病原，可以引起豬及某些哺乳動物乃至靈長類動物的一種以腦炎、心肌炎或心肌周圍炎為主要特征的急性傳染病。1958年，巴拿馬首次報道EMCV能夠感染豬并引起豬急性致死性心肌炎[1]。后來發(fā)現(xiàn)EMCV與豬的繁殖障礙也有關(guān)聯(lián)[2]?，F(xiàn)在世界上主要養(yǎng)豬國家都有該病流行的報道[3]。我國于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV[4]，證實國內(nèi)豬場存在該病。規(guī)?；i場血清學(xué)調(diào)查表明，我國豬場普遍感染EMCV，血清抗體陽性率很高[5]，豬腦心肌炎已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要隱患。

EMCV感染很常見，但臨床癥狀卻很少見，常呈亞臨床狀態(tài)。實驗經(jīng)口感染仔豬，接種6小時即可在腸道檢測到病毒；接種后3天，可在肝臟、腎臟、脾臟和肺臟分離到病毒[6]。因此，在EMCV隱性感染和感染早期診斷該病具有重要意義。獵人及動物園獸醫(yī)雖可感染EMCV，并產(chǎn)生特異性抗體[7-8]，但其公共衛(wèi)生影響并未受到重視。近年隨著異種器官移植的興起，豬作為人類器官移植的重要供體動物，EMCV對人類健康的隱患受到越來越多的關(guān)注[9]。因此，亟待建立敏感、特異、快速的檢測方法來診斷該病。本研究采用Taqman探針技術(shù)，建立了EMCV實時熒光RT-PCR方法，為EMCV快速診斷提供了有效的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 血樣和毒株 檢測血樣采集自上海郊區(qū)某豬場，從美國、加拿大和法國引進的種豬；豬腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）、豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）由本實驗室保存。

1.2 試劑和儀器 Ex Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq （Probe qPCR）、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、DNA Marker、pMD19-T載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；RNA提取試劑盒（Cat No.74106）購自Qiagen有限公司。主要儀器為ABI ViiA 7熒光定量PCR儀。

1.3 引物和探針 應(yīng)用BioEdit 軟件對實驗室分離毒株及GenBank 數(shù)據(jù)庫中的EMCV基因序列進行同源性比對， 利用Beacon Designer軟件在EMCV基因組保守區(qū)域設(shè)計并合成一對特異性引物和TaqMan 熒光探針。 探針的5'端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM， 3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMRA。EMCVFP：5’-GGGATCAGCTTTTACGGCTTT-3’，EMCVRP：5’-CCCATGCATCCGATAGAGAAC-3’，EMCV Probe：5’（FAM）CGATGCCAACGAGGACGCCC（TAMRA）3’， 擴增片段長度為95bp。 另外， 針對EMCV保守區(qū)域設(shè)計了一對常規(guī)RT-PCR引物用于制備陽性質(zhì)粒， 引物序列為EMCVF：5'-CATTGAGACAAATCCAGGGCC-3'，EMCVR：5'- ATCTGCTCAAGAGCTGCTTCC-3’，產(chǎn)物286bp。 引物和探針由英維捷基（上海）公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取 按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取病料組織中的病毒基因組RNA。

1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 以EMCVF和EMCVR為引物，擴增EMCV基因保守序列區(qū)，擴增片段長度為280bp。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結(jié)果。膠回收目的片段，連入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定和序列測定，獲得測序完全正確的質(zhì)粒pMDEMCV作為陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，質(zhì)粒用NanoDrop（Thermo Scientifc）微量分光光度計測量OD260，根據(jù)公式計算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用無RNA酶水對陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，取5個稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，優(yōu)化引物和探針的濃度、Tm值及反應(yīng)時間，進行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，計算Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗 應(yīng)用建立起來的熒光定量RTPCR方法對PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV進行特異性試驗。

1.8 敏感性試驗 用107拷貝/μL陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做熒光定量PCR，進行敏感性試驗。

1.9 重復(fù)性試驗 取3份病毒含量不同的樣品進行批間重復(fù)性試驗和批內(nèi)重復(fù)性試驗。

1.10 病料的檢測 應(yīng)用建立起來的TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對145份采自上海郊區(qū)某豬場從美國、加拿大、法國引進的種豬血清樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以提取的細(xì)胞毒總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%濃度瓊脂糖凝膠電泳后，可見約280bp的基因片段，與預(yù)期基因片段的大小相一致（圖1）。回收該目的基因片段，將其連入pMD19-T載體，測序結(jié)果表明擴增獲得的目的基因片段與毒株已知序列同源性為100%，可用作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。經(jīng)分光光度計測定，計算得出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為1.88×1010拷貝/uL。

圖1 EMCV基因的RT-PCR擴增

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將pMDEMCV質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋至1.88×103～1.88×107拷貝/μL共5個濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個重復(fù)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL， 包括2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，上、下游引物（10 pmol/ L）各0.8μL，探針（10 pmol/L）0.8μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，模板（質(zhì)?；騝DNA）2μL，DEPC 水5.2μL 。反應(yīng)條件為：95℃變性 40s；以95℃變性20 s，56℃退火延伸25 s， 45個循環(huán)擴增；在56℃采集熒光。結(jié)果pMDEMCV的各濃度均有很好的線性關(guān)系，陰性對照無擴增反應(yīng)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999， 擴增效率E=98.11%（圖 2 a 和b）。

2.3 敏感性與特異性試驗

將陽性質(zhì)粒pMDEMCV按照101-1012梯度稀釋作為模板，進行TaqMan 實時熒光定量RTPCR 檢測， 最低檢出量為10 拷貝/μL（圖3）。以對照病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV和EMCV用建立起來的熒光定量RT-PCR做檢測，結(jié)果顯示針對EMCV的檢測方法檢測PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV均為陰性（圖4），說明本方法特異性很好。

圖2實時熒光定量PCR檢測EMCV的動力學(xué)曲線（a）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）

圖3 Taqman實時熒光定量PCR檢測EMCV的敏感性試驗

圖4 Taqman實時熒光定量RT-PCR檢測EMCV的特異性試驗

2.5 重復(fù)性試驗

對含量不同的3份EMCV感染樣品做5個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，變異系數(shù)均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好（表1）。

表1 實時熒光定量RT-PCR 檢測EMCV批內(nèi)及批間重復(fù)試驗結(jié)

2.6 臨床樣品檢測

應(yīng)用建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR方法，檢測采集自上海郊區(qū)某豬場，從美國、加拿大、法國引進種豬的血清樣本共計145份，結(jié)果顯示供港豬場樣品30份陽性（30/56），美國種豬8份樣品陽性（8/29），加拿大種豬6份陽性（6/30），法國種豬8份陽性（8/30）（表2）。

表2 應(yīng)用熒光定量RT-PCR 檢測豬血清樣品中EMCV 的結(jié)果

3 討論

目前， EMCV的分子檢測方法主要有普通PCR和實時（Real-time）PCR。Real-time PCR秉承及發(fā)展了普通PCR的快速、高靈敏度檢出等全部優(yōu)點，同時克服了普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等不足，可以說Real-time PCR使PCR技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，擴展了PCR技術(shù)的應(yīng)用范疇，逐漸成為動物疫病診斷的主要方法。Real-time PCR是通過檢測反應(yīng)體系中的熒光強度來檢測PCR擴增產(chǎn)物的，其熒光檢出方法可分為熒光嵌入法（SYBR Green I）和熒光探針法兩種。由于SYBR Green I定量PCR體系中使用的SYBR Green I染料非特異性結(jié)合雙鏈DNA，染料分子除了與特異性的靶序列擴增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與反應(yīng)體系中的引物二聚體、污染的基因組DNA、PCR擴增過程中形成的非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。特異性強是熒光探針法無可替代的優(yōu)點。

本研究建立了針對EMCV的基于Taqman探針的實時熒光定量RT-PCR 方法，通過特異性、敏感性和重復(fù)性試驗檢驗，結(jié)果表明，該方法均具有較高的敏感性，最低可檢測到10 拷貝/μL 的陽性標(biāo)準(zhǔn)品；特異性強，對EMCV檢測結(jié)果為陽性，但對其他常見豬源病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV的檢測結(jié)果均為陰性；重復(fù)性好，對含有EMCV的3份病毒樣品進行5 個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗，變異系數(shù)均小于2%。應(yīng)用建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR方法，檢測采集自上海郊區(qū)豬場，美國、加拿大、法國進境種豬血清樣本共計145份，共檢出52份陽性樣品，證明該方法可靠。EMCV Taqman實時熒光定量RT-PCR方法的建立，為EMCV快速診斷及EMCV準(zhǔn)確定量提供了有效的技術(shù)平臺。

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Development and Application of Taqman Real-time RT- PCR Assay for Detection of Porcine Encephalomyocarditis Virus

Zhang Qiang， Wang Qiaoquan， Xiong Wei， Li Shuqing， Li Jian， Lin Yingzheng， Huang Zhongrong（Shanghai Entry-Exit Inspection and Qarantine Bureau，Shanghai，200135）

A Taqman real-time fuorescence quantitative PCR was established using primers and probe based on the conserved region of encephalomyocarditis virus（EMCV） genomes. The amplifcation sequence of EMCV was cloned into the pMD19-T vector and a series of diluted recombinant plasmid was used to generate standard curves. The real-time quantitative PCR assay could detect as less as 10 copies of target cDNA of EMCV. The assay showed good specifcity with negative reactions for other porcine viruses（PTV，PRRSV，CSFV，JEV and TGEV）. The variation coeffcient of intra-batch or inter-batch was below 2%，indicating good reproducibility. 145 serum samples of pigs from domestic farms and USA，Canada，F(xiàn)rance were detected by the real-time PCR，and the results showed that 53.6%，27.6%，20%and 26.7% of the sample were positive for EMCV respectively. The method can be used for EMCV infection investigation.

encephalomyocarditis virus； real-time fuorescence quantitative PCR； Taqman probe

S852.659.5； S858.23

：A

：1005-944X（2014）05-0081-04

上海檢驗檢疫局科技項目（HK012-2010）