，，，，

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，伊寧835000）

馬泰勒蟲(chóng)二溫式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李佳1，李永暢1，王振寶2，張楊1，巴音查汗1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，伊寧835000）

為給馬泰勒蟲(chóng)提供特異、快速、敏感的檢測(cè)方法，根據(jù)馬泰勒蟲(chóng)18S rRNA保守基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立馬泰勒蟲(chóng)二溫式PCR檢測(cè)方法。擴(kuò)增出的目的片段大小為139 bp，經(jīng)克隆、測(cè)序分析，與GenBank上登錄的序列相似性為100%。該方法與其他蟲(chóng)種無(wú)交叉反應(yīng)，具有一定的靈敏性和特異性。應(yīng)用所建立的方法對(duì)采集的30份疑似病例全血樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為33.3%，相比之下相同樣品的血液涂片檢查的陽(yáng)性率為13.3%。與三溫PCR方法比較減少了反應(yīng)時(shí)間的消耗，提高了檢測(cè)效率，該方法對(duì)馬泰勒蟲(chóng)病的早期（潛伏感染期）檢測(cè)、診斷具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

馬泰勒蟲(chóng)；18S rRNA；二溫式PCR；檢測(cè)

馬泰勒蟲(chóng)（Theileriaequi）是由媒介蜱傳播的一種血液寄生蟲(chóng)，主要感染馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞，潛伏期可達(dá)24天，在臨床上主要表現(xiàn)為高熱、黃疸、貧血、淋巴結(jié)腫大等癥狀[1]，如不及早診斷和及時(shí)治療極易導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重影響馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病具有一定的季節(jié)性和區(qū)域性。我國(guó)主要馬產(chǎn)區(qū)均有該病發(fā)生的報(bào)道[2]，我們實(shí)驗(yàn)室遇到的病例亦很普遍。由于馬泰勒蟲(chóng)病危害大，不容易根治，對(duì)國(guó)際貿(mào)易產(chǎn)生很大影響，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將馬泰勒蟲(chóng)病列為重要?jiǎng)游锛膊?，我?guó)將其列為二類(lèi)病[3]。近年來(lái)該病呈上升趨勢(shì)，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)優(yōu)良馬匹也有所增加，為防止馬泰勒蟲(chóng)病的傳入、傳出，馬泰勒蟲(chóng)病檢驗(yàn)檢疫工作尤為關(guān)鍵。本研究依據(jù)PCR技術(shù)原理[4-5]，建立了二溫式PCR檢測(cè)方法，該方法比傳統(tǒng)的血液涂片方法要快速、靈敏，與三溫PCR相比較，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。該方法的建立，為馬泰勒蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查及疫病監(jiān)控提供簡(jiǎn)便、快捷、高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株與檢測(cè)樣品

馬泰勒蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床疑似病例樣品采自新疆伊犁昭蘇縣，共30份抗凝全血。

1.2 主要試劑及儀器

全血DNA提取試劑盒（DNA Mini Kit）購(gòu)自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000 Marker、pXT19-T載體、膠回收試 劑 盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（Mini BEST Plasmid Purifcation Kit Ver.3.0）等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；NANODROP 2000c、TProfessional PCR儀購(gòu)自Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上登錄的馬泰勒蟲(chóng)18S rRNA基因序列，利用Primer Premier 6.0和Oligo軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物（T.e-F：5’-TTGCGGTGTTTCGGTGA-3’；T.e-R：5’-TCTCCGGAATCGAACCC-3’），目的片段大小為139 bp，由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 馬泰勒蟲(chóng)DNA的提取

將臨床癥狀為馬泰勒蟲(chóng)病，且經(jīng)血液涂片染色鏡檢為陽(yáng)性的馬泰勒蟲(chóng)病的抗凝血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，用紫外分光光度儀測(cè)DNA的含量，置 20℃保存。

1.5 二溫式PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

PCR反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行，對(duì)影響PCR反應(yīng)的主要參數(shù)Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品制備

使用膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收和純化，將回收的PCR產(chǎn)物與pXT19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.7 特異性試驗(yàn)

以馬泰勒蟲(chóng)基因組DNA為試驗(yàn)樣本，同環(huán)形泰勒蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)基因組DNA為對(duì)照樣本，按照最佳退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢驗(yàn)其特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)

對(duì)所提取的馬泰勒蟲(chóng)DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，對(duì)該模板進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)褂米罴逊磻?yīng)條件進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增，確定反應(yīng)體系的敏感性。

1.9 樣品檢測(cè)

使用建立的方法對(duì)采自新疆伊犁的30份疑似病例樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與血液涂片染色進(jìn)行鏡檢進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)二溫式PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定的最佳反應(yīng)體系為（25 μL）：10 ×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol）2 μL，dNTPs（2.5 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 u/μL）0.2 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；95℃ 15s，61℃ 45s，40個(gè)循環(huán)；61℃延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出條帶大小為139bp的電泳條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的片段大小相符（圖1）。

圖1 PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件的優(yōu)化

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將提取的質(zhì)粒進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增，得到一條與預(yù)期大小一致的特異性片段，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)DNA Star軟件分析比對(duì)，PCR產(chǎn)物序列與參照序列（GenBank錄號(hào)為EU462510）相似性達(dá)100%（圖2）。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

使用優(yōu)化的二溫式PCR方法，分別通過(guò)對(duì)馬泰勒蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有馬泰勒蟲(chóng)在139 bp處有條帶出現(xiàn)（圖3），而其他樣品均無(wú)條帶出現(xiàn)，說(shuō)明該方法對(duì)馬泰勒蟲(chóng)具有特異性。

圖3特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn)

對(duì)所提取的馬泰勒蟲(chóng)DNA，使用紫外分光光度儀測(cè)定DNA的含量，計(jì)算DNA的濃度（原始濃度為38 ng/μL），然后以10倍系列稀釋進(jìn)行二溫式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示在樣品稀釋107倍時(shí)還有可見(jiàn)的條帶（圖4），說(shuō)明檢測(cè)最低含量為38 fg。

圖4敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)

通過(guò)對(duì)采自新疆伊犁新源縣30份全血分別使用所建立的二溫式PCR方法和血液涂片檢測(cè)。結(jié)果二溫式PCR的陽(yáng)性檢出率為33.3%，血液涂片陽(yáng)性檢出率為13.3%，且通過(guò)血液涂片檢測(cè)出的陽(yáng)性，PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性；部分血液涂片檢測(cè)出的陰性，通過(guò)建立的PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性。說(shuō)明所建立的二溫式PCR 方法比傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢方法更敏感，可用于馬泰勒蟲(chóng)病的早期及隱性感染病例的檢測(cè)。

3 討論

本研究依據(jù)常規(guī)PCR基本原理，將退火和延伸溫度合二為一而建立了二溫式PCR。對(duì)比二溫式PCR 與常規(guī)PCR檢測(cè)方法，二者在檢測(cè)的敏感性方面無(wú)顯著差異，但二溫式PCR的退火和延伸過(guò)程是在同一溫度下進(jìn)行，其最佳溫度為61℃，使引物與模板能準(zhǔn)確結(jié)合而且穩(wěn)定性好，以減少非特異擴(kuò)增[6-7]，在整個(gè)循環(huán)中只有兩個(gè)溫度變化，操作上較常規(guī)三溫式PCR更為簡(jiǎn)單，還可縮短操作時(shí)間，使對(duì)病原的檢測(cè)更省時(shí)、快捷，此方法可以應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查和大量臨床樣品檢測(cè)。

該方法還可避免血清學(xué)（免疫學(xué)方法）方法檢測(cè)的假陽(yáng)性。當(dāng)馬匹感染蟲(chóng)體后，機(jī)體產(chǎn)生抗體（經(jīng)治療將體內(nèi)蟲(chóng)體殺死，其抗體水平可持續(xù)一段時(shí)間），通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)會(huì)造成假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果[8]。

該方法比傳統(tǒng)的血液涂片方法要快捷、檢出率高的特點(diǎn)。血液涂片染色鏡檢結(jié)果易受到很多因素的影響，如處于帶蟲(chóng)狀態(tài)的隱性感染，并無(wú)明顯癥狀的馬匹或操作不當(dāng)及使用較差等顯微鏡等情況下發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體是很困難的[9]。

本實(shí)驗(yàn)，對(duì)采自的疑似病例馬匹30份樣品進(jìn)行了血液涂片染色鏡檢（陽(yáng)性率為13.3%）的同時(shí)，使用所建立的二溫式PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了檢樣（陽(yáng)性檢出率為33.3%），結(jié)果表明二溫PCR檢測(cè)方法比血涂片檢測(cè)方法更特異、更敏感，更適合于本病的早期診斷、隱性感染和流行病學(xué)調(diào)查研究。

[1] 羅金.馬泰勒蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)定位佐證及PCR、ELISA檢測(cè)方法的建立[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：1-8.

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Establishment and application of a two-temperature PCR assay for detection of Theileria equi

Li Jia1，Li Yongchang1，Wang Zhenbao2，Zhang Yang1，Bayin Chahan1
（1.College of Animal Medicine，Xinjiang Agriculture University，Urumqi， Xinjiang 830052；2.Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yining，Xinjiang 835000）

To establish a specifc， rapid and sensitive detection method for Theileria equi（T.equi）， a pair of specific primers was designed according to the conservative 18S rRNA gene sequence of T.equi and a two-temperature PCR assay for T.equi was established. The amplifed target fragment，139 bp in size was cloned and sequenced. Compared with the GenBank registered sequence，the similarity was 100% by sequence analysis.The assay showed no cross-reaction with other protozoon parasites，suggesting high specifcity. 30 whole blood samples collected were tested by the developed assay，and the positive rate of T.equi was 33.3%.While the positive rate of blood smear test was 13.3%.Compared with the three-temperature PCR assay， the reaction time was reduced and the detection effciency improved.The twotemperature PCR assay could be used for early detection and diagnosis of latent infection by T.equi with practical value.

T.equi；18S rRNA；two-temperature PCR；detec

S852.723； S858.21

：A

：1005-944X（2014）05-0078-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD46B01-04）

巴音查汗（E-mail）bynch@hotmail.com