鄭小龍，朱來(lái)華，王 群，艾 軍，鄧明俊，肖西志，梁成珠，姜 帆，于業(yè)鋒

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002；2.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南 昆明 650000）

非洲馬瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲馬瘟病毒（African horse sickness，AHSV）引起的馬屬動(dòng)物的一種急性和亞急性蟲(chóng)媒傳染病[1-2]。AHS可感染所有馬屬動(dòng)物，但以馬最為易感，可引起動(dòng)物發(fā)熱、皮下水腫及臟器出血，病死率可達(dá)90%以上。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。

AHS主要分布在非洲大部，另外在地中海周邊國(guó)家、中東、歐洲等也有發(fā)生，近年來(lái)該病已經(jīng)在亞洲個(gè)別國(guó)家相繼出現(xiàn)，目前我國(guó)尚未有AHS感染的報(bào)道，但隨著世界經(jīng)濟(jì)及我國(guó)對(duì)外貿(mào)易的快速發(fā)展以及賽馬參加國(guó)際比賽的機(jī)會(huì)增多，該病進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。

目前已發(fā)現(xiàn)AHSV有9個(gè)血清型[3-4]，其病毒基因組包含10個(gè)dsRNA片段，編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]。其中VP7結(jié)構(gòu)蛋白為主要的內(nèi)衣殼蛋白，并已證實(shí)其為AHSV的群特異性抗原[7-8]，可檢測(cè)到9個(gè)AHSV血清型的抗體。本文利用VP7重組蛋白建立了檢測(cè)AHS的IgM 捕獲ELISA（MAC-ELISA）方法，為非洲馬瘟早期感染的診斷提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及特異血清 VP7原核表達(dá)質(zhì)粒由云南檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心惠贈(zèng)；陽(yáng)性血清、陰性血清購(gòu)自英國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生研究所（IAH）。

1.1.2 試劑 T載體、DNA連接酶 、限制性?xún)?nèi)切 酶 Bam HI、Xho I、DNA marker， 購(gòu)自大連Takara公司；rTaq DNA聚合酶、RT-PCR Taqmix、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司； His-Bind?Purif i cation Kit為 Novagen公司產(chǎn)品；瓊脂糖、IPTG和DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海生工公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；羊抗馬IgM購(gòu)自Abcam公司；其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 VP7表達(dá)載體的構(gòu)建

李富祥[9]等根據(jù)VP7基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于擴(kuò)增和鑒定VP基因，上游引物AH1：5’-CCC TCTAGAATGGACGCGATAGCAGCAAAG-3’（下劃線部分為Xba I酶切位點(diǎn)），下游引物AH2：5’-GGGAAGCTTCTAGTGGTAGGCTGCTAGC AC-3’（下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1080bp。將擴(kuò)增片段插入PET-32a表達(dá)載體中，構(gòu)建pET-VP7表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌中，然后接種于含100mmol/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以10%的量接種于含Amp的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4～0.6時(shí)分別加入1.0mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)5h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定

將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)印及反應(yīng)，一抗采用AHSV-1型陽(yáng)性血清，二抗為羊抗馬IgG-HRP。用DAB試劑顯色。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)His-Bind柱純化

根據(jù)Novagen公司的His-Bind? Purif i cation Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取不同時(shí)間的洗脫液進(jìn)行電泳鑒定分析。

1.2.5 多克隆抗體的制備與標(biāo)記

1.2.5.1 多克隆抗體的制備

將純化后的 pET-VP7蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，頸部皮下注射家兔（100μg/只），兩周后注射弗氏不完全佐劑與蛋白的混合液，以后每隔兩周注射一次，共免疫注射 3次后采血，收集的血清即為多克隆抗體， 用 ELISA 方法測(cè)定其效價(jià)。

1.2.5.2 多克隆抗體標(biāo)記

采用Sigma HRP標(biāo)記試劑盒（P8415）標(biāo)記多克隆抗體。結(jié)合物酶活性和免疫反應(yīng)性的鑒定，采用直接ELISA法與相應(yīng)抗原進(jìn)行反應(yīng)，即將酶標(biāo)抗體按1:103，1:104，1:105，1:106稀釋后直接與ELISA板上包被的pET-VP7進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定酶標(biāo)抗體的效價(jià)并選擇其最佳工作濃度。

1.2.6 VP7抗原和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

1）將羊抗馬IgM用包被緩沖液作1:400稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板，每孔100μL，4℃包被過(guò)夜。

2）用洗液洗板3次，加入封閉液，每孔200μL，37℃ 2h。

3）用洗液洗板3次，將陰性和陽(yáng)性血清按照1:50，1:100，1:200，1:400，1:800稀釋?zhuān)靠准?00μL，37℃ 1h。

4）用洗液洗滌3次，加入pET-VP7抗原1:100， 1:200， 1:400， 1:800， 1:1600， 1:3200，1:6400， 每孔加100μL，37℃ 1h。

5） 用洗液洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的pETVP7（1:10000）抗體，每孔加100μL，37℃ 1h。

6）用洗液洗滌3次，每孔加100μLTMB，37℃ 避光 10min。

7）加入終止液，每孔加100μL，450nm讀數(shù)。

從數(shù)值中找出OD值在1.0左右，且陽(yáng)性血清OD值比陰性血清OD值（P/N值）最高的作為最適稀釋度。

1.2.7 酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定

按照1.2.5中確定的抗原及血清最佳稀釋倍數(shù)，進(jìn)行試驗(yàn)。將抗酶標(biāo)抗體作1:5000，1:10000，1:20000，1:50000，1:100000稀釋?zhuān)凑丈鲜霾襟E進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.8 特異性評(píng)價(jià)

應(yīng)用建立的捕獲ELISA方法對(duì)AHSV陽(yáng)性血清（1-9型）、AHSV陰性血清、馬動(dòng)脈炎陽(yáng)性血清、馬動(dòng)脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽(yáng)性血清、WEEV陽(yáng)性血清、WEEV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)所建立方法的特異性。

1.2.9 重復(fù)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

根據(jù)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)捕獲ELISA方法的穩(wěn)定性。批內(nèi)差異：使用同一批次包被的酶標(biāo)板對(duì)3份血清進(jìn)行檢測(cè)，每份血清設(shè)置4個(gè)重復(fù)，計(jì)算其變異系數(shù)；批間差異：取4次不同時(shí)間包被的酶標(biāo)板，同時(shí)對(duì)1份血清進(jìn)行檢測(cè)，每塊板上設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.10 建立的捕獲ELISA方法與進(jìn)口試劑盒比較

選取180份馬血清樣品，同時(shí)用建立的捕獲ELISA與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白pET-VP7的純化

將表達(dá)蛋白用His-Bind層析柱純化。取不同時(shí)間的洗脫樣品進(jìn)行鑒定，由圖1可知目標(biāo)蛋白仍有較高的濃度，盡管存在極少量的雜蛋白，但目標(biāo)蛋白占有絕對(duì)多的含量，表明純化效果達(dá)到預(yù)期的目的。應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司）檢測(cè)純化蛋白含量為500μg/mL。

圖1 表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化

2.2 Western-blot 結(jié)果

經(jīng)Western-blot 檢測(cè)，在目標(biāo)條帶所處的位置（54kD左右）出現(xiàn)一條印跡（圖2），表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析

2.3 多克隆抗體的制備與標(biāo)記

免疫三次后采血，分離血清，將待檢血清進(jìn)行10倍系列梯度稀釋?zhuān)珽LISA法檢測(cè)血清中抗體水平（樣品設(shè)平行）。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)三次免疫后pETVP7抗體的滴度大于10-7。將純化好的血清用Sigma試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后直接ELISA法進(jìn)行特異性檢測(cè)得知，HRP標(biāo)記的抗pET-VP7抗體的工作濃度為104～105，詳細(xì)工作濃度按具體試驗(yàn)而定。

2.4 VP7抗原和血清最佳稀釋倍數(shù)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知：當(dāng)抗原 1:800稀釋?zhuān)?:100稀釋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照OD值為1.0左右，且P/N的值最大，因此我們選定抗原的稀釋倍數(shù)為1:800（0.625μg/mL），血清最佳稀釋倍數(shù)為1:100。

2.5 酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)

將羊抗馬IgM作1:400稀釋包被酶標(biāo)板，血清1:100稀釋?zhuān)乖?:800，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明當(dāng)酶標(biāo)抗體1:10000稀釋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照OD值為1.1左右，且P/N的值最大，因此，酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:104。

2.6 結(jié)果判定

對(duì)已知的AHSV陽(yáng)性和陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，10份陽(yáng)性血清均P/N≥2.1，30份陰性血清值均P/N＜2.1，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，將P/N≥2.1界定為陽(yáng)性，P/N＜2.1界定為陰性。

2.7 特異性評(píng)價(jià)

應(yīng)用建立的捕獲ELISA方法對(duì)AHSV陽(yáng)性血清、AHSV陰性血清、馬動(dòng)脈炎陽(yáng)性血清、馬動(dòng)脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽(yáng)性血清、WEEV陽(yáng)性血清、WEEV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法能夠檢測(cè)出AHSV陽(yáng)性血清（1-9型），特異性高，與其他病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。

2.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

應(yīng)用所建立的捕獲ELISA方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)分別為2.31%、1.29%、4.01%；批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)為6.21%；結(jié)果顯示批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.9 IgM 捕獲ELISA與進(jìn)口試劑盒比較

取180份馬血清樣品分別用進(jìn)口試劑盒和本研究建立的捕獲ELISA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)出的14份陽(yáng)性樣品中，捕獲ELISA檢測(cè)10份為陽(yáng)性，4份為陰性；進(jìn)口ELISA檢測(cè)166份陰性的樣品，捕獲ELISA檢測(cè)170份為陰性。兩種ELISA均為陽(yáng)性的為10份，均為陰性的為166份，因此總符合率為97.7%。

3 討論

由于非洲馬瘟目前在我國(guó)還沒(méi)有疫情發(fā)生的報(bào)道，因此我國(guó)在對(duì)該病的防控方面目前還沒(méi)有具體的措施，也沒(méi)有自主產(chǎn)權(quán)的非洲馬瘟疫苗和診斷試劑。為了防止國(guó)外疫情傳入我國(guó)，盡早開(kāi)展對(duì)非洲馬瘟診斷試劑的研制，建立簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)我國(guó)新興馬業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

因?yàn)镮gM抗體在機(jī)體感染后最早出現(xiàn)（7-10天），因而是早期感染的重要標(biāo)志性抗體。MACELISA是對(duì)常規(guī)的直接或間接ELISA的重要改進(jìn)，包被抗IgM抗體的微量板可以捕獲樣品中所有類(lèi)型IgM，而不同病原微生物感染僅產(chǎn)生各種特異性的IgM抗體，可結(jié)合其自身特異性微生物。在進(jìn)行MAC-ELISA，只需要加入特定的抗原，就可以檢測(cè)特定的動(dòng)物疾病，具有廣闊的通用性。而且IgM是早期感染引起的抗體，MAC-ELISA是早期感染診斷的重要工具，早期診斷意義重大，可以迅速采取檢疫、防疫措施，避免疫情進(jìn)一步擴(kuò)散。

本文通過(guò)對(duì)抗原濃度、血清稀釋度、酶標(biāo)抗體稀釋度等條件進(jìn)行摸索，最終確定了最佳的反應(yīng)濃度及稀釋度。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本文建立的MAC-ELISA方法僅能檢測(cè)出AHSV陽(yáng)性血清，特異性高，與其他病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。在與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比對(duì)時(shí)，進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出的4份陽(yáng)性樣品，捕獲ELISA檢測(cè)為陰性，且無(wú)法用其他方法（如中和試驗(yàn)等）進(jìn)行驗(yàn)證，存在假陰性的問(wèn)題，可能與血清采集期有關(guān)，感染后期采集的血清中IgM含量會(huì)降低。

本文建立的MAC-ELISA方法特異性強(qiáng)，可用于早期病毒感染產(chǎn)生的IgM抗體的檢測(cè)，且適用范圍較廣，符合出入境動(dòng)物檢疫、國(guó)內(nèi)疫病疫情快速檢測(cè)的需要，為早期感染的診斷提供了一種簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏的檢測(cè)手段。

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