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（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

江蘇部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)檢測

管 萌，宿春虎，許晨旭，劉 星，楊 林，婁亞坤，焦庫華，陳素娟，彭大新，劉秀梵

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性PCV2的鑒定引物，利用PCR方法對(duì)65份疑似PCV2感染的病料進(jìn)行檢測。PCR檢測為陽性的病料經(jīng)處理后，接種無PCV污染的Dulac細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測。對(duì)各分離毒株的全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和基因型分析。結(jié)果表明：共分離鑒定21株P(guān)CV2，均屬2b基因型，其中有16株為1C群，5株為1A/1B群。研究顯示PCV2b 1C群已在江蘇成為流行毒株。

豬圓環(huán)病毒2型；分離；鑒定；基因型

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）可分為PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV2被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原[1]，同時(shí)與皮炎與腎病綜合征、增生性壞死性間質(zhì)肺炎、呼吸道綜合征、繁殖障礙、先天性震顫、腸炎等臨床癥狀相關(guān)[2-4]。該病還可引起免疫抑制，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。基于PCV2基因組序列特性，將PCV2分為兩個(gè)主要的基因型（PCV2a和PCV2b），以及8個(gè)基因群（PCV2b-1A～PCV2b-1C和PCV2a-2A～PCV2a-2E）[5]。不同地區(qū)和不同年代流行的毒株基因型不同，基因群也在變化[6]。為了進(jìn)一步了解江蘇省近年來PCV2流行狀況及病毒變異情況，本試驗(yàn)從江蘇省揚(yáng)州、泰州、鹽城等地采集疑似PCV2感染豬的病料，進(jìn)行PCR檢測、病毒分離、全基因組序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，為PCV2的防控提供了流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源

病料主要來源于江蘇省揚(yáng)州、泰州、鹽城等地區(qū)，其病豬主要表現(xiàn)為精神不振、食欲不佳、皮毛粗亂、皮膚蒼白、常伴全身組織黃染；有的在耳部、腹部可見出血性紫紅色斑塊；部分仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，震顫，四肢呈劃水狀。剖檢變化為全身淋巴結(jié)腫大，特別是腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)最為明顯；肺臟腫大，呈間質(zhì)性肺炎。無菌采集病豬的淋巴結(jié)、肺臟、肝臟、脾臟等組織，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑與細(xì)胞系

DNA提取試劑盒購自大連Takara生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO生物工程公司；D-氨基葡萄糖、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自美國Sigma公司；Dulac細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)PCR檢測PCV1和PCV2均為陰性；PCV2陽性血清是用原核表達(dá)的GST-Cap融合蛋白免疫Balb/C小鼠制得的鼠多抗血清。

1.2方法

1.2.1PCR檢測

根據(jù)GenBank中登錄的PCV2核酸全序列（GeneBank Accession：PCV2b-AF055394，PCV2a-AF055392），利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)了1對(duì)PCV2特異性的PCR引物P1和P2（表1），擴(kuò)增長度為569 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物15μl在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

表1本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.2病毒分離與培養(yǎng)

PCR檢測陽性組織研磨制成無菌懸浮液后離心取上清，按50 ml/L的比例接種60%～70%融合的Dulac細(xì)胞，吸附1 h后37℃培養(yǎng)24 h。用300 mmol/L D-氨基葡萄糖處理30 min，棄去D-氨基葡萄糖，用pH 7.4的 10 mmol/L無菌PBS洗滌2次，然后加入含0.5%胎牛血清的細(xì)胞維持液，37℃繼續(xù)孵育48～72 h后傳代培養(yǎng)。連續(xù)盲傳6代后提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.3間接熒光試驗(yàn)

以50 ml/L的比例將盲傳細(xì)胞培養(yǎng)物接入已長成單層Dulac細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)48 h后棄去維持液，用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌3次，冷丙酮固定細(xì)胞，50 μL/孔，4℃30 min；洗滌后加入1∶1000稀釋的PCV2抗體，50 μL/孔，37℃作用1 h；洗滌后加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，50 μL/孔，37℃作用1 h；洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4全基因組克隆和測序

以P3和P4（表1）引物擴(kuò)增PCV2基因組，片段長度為1767bp或1768bp。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體，酶切鑒定后陽性質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。應(yīng)用Lasergene7.1軟件對(duì)測序基因片段進(jìn)行拼接和同源比對(duì)，應(yīng)用MEGA4.0軟件NJ法繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1病料PCR的擴(kuò)增

將疑似PCV2感染的病料組織提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后可見1條600bp左右的條帶（圖1），與預(yù)期相符。病料的陽性檢出率為32.3%（21/65）。

圖1部分病料中PCV2的PCR檢測結(jié)果

2.2間接免疫熒光檢測結(jié)果

盲傳6代后細(xì)胞接種Dulac細(xì)胞后經(jīng)PCV2抗體染色后，細(xì)胞核內(nèi)呈特異性亮綠色熒光（圖2），而PCV陰性血清、PRV、PPV和PRRSV陽性血清沒有特異性熒光，共鑒定出21株P(guān)CV2（表2）。

2.3全基因序列測定及分析

對(duì)分離的陽性樣品用引物P3/P4擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物大小約1800 bp（圖3），連接至T載體后測定序列，全長均為1767 bp。從GenBank中選取16株來自不同國家和地區(qū)的PCV2基因組序列（表3），與21 株分離株的全基因組序列進(jìn)行比較，繪制進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明分離到的21株P(guān)CV2均為PCV2b亞型，其中16株為PCV2b 1C，5株為PCV2b 1A/1B。

圖2 PCV2部分分離株IFA結(jié)果（20×）

表2 21株P(guān)CV2的來源和命名

圖3 PCV2部分分離毒株基因組全長擴(kuò)增結(jié)果

表3本實(shí)驗(yàn)中引用的PCV2參考序列

2.4PCV2 ORF2序列分析

截取2 1株P(guān) C V 2分離株的ORF2基因序列進(jìn)行比對(duì)，PCV2分離株ORF2 序列之間的核苷酸同源性為94.3%～100%，與參考序列AY146991（PCV2a）同源性為92.0%～93.6%、EU909688（PCV2b）同源性為94.3%～99.1%、EU148505（PCV2c）同源性為89.0%～90.7%。

氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)主要變異位點(diǎn)為53～91、121～151、190～210和230～234，在第8、169和215等位點(diǎn)也有變異（圖5、表3）。PCV1A/1B 群擁有Y8、R59、R89、E90、S121、A190和E210位點(diǎn)，而PCV 1C群擁有I53、K59、N68、L89、T90、N134、R/G169、T190、I215和K234位點(diǎn)。

3 討論

PMWS自1991年加拿大首次報(bào)道以來逐漸呈流行趨勢，而PCV2感染是引起PMWS必不可少的致病因素[7]。郎洪武等在2000年首次在我國檢測到PCV2，其陽性率為43.9%[8]。張建武等在對(duì)全國PCV2流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬PCV2陽性率為28.85%（60/208），健康豬為6.12%（3/49），總陽性率為24.51%（63/257）[9]。趙津等對(duì)華東地區(qū)的 2008—2010年期間收集的1017份血清樣品進(jìn)行PCV2的檢測總陽性率達(dá)到59.9%[10]。郭抗抗等對(duì)NCBI 中登錄的556個(gè)PCV2分離株全基因序列進(jìn)行分析顯示1999—2002 年所登錄的PCV2的優(yōu)勢流行毒株為基因A型（PCV2a）；從2003年開始基因B型（PCV2b）逐漸為優(yōu)勢流行毒株[11]。本研究中，對(duì)江蘇省不同地區(qū)發(fā)病豬的65份病料進(jìn)行檢測，檢出率為32.3%，經(jīng)測序比對(duì)均為PCV2b型，表明目前PCV2b仍然是江蘇地區(qū)的優(yōu)勢基因型。

圖4 PCV2分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 PCV2分離株間ORF2的氨基酸序列差異性分析

PCV2b中的1A/1B在2001—2008年間為主要的基因群，而1C在2002年首次發(fā)現(xiàn)以后，2009年以后逐漸成為占主導(dǎo)的基因群[6]。在我們分離出的21株P(guān)CV2中有5株屬于1A/1B基因群，16株為1C基因群。PCV21A/1B基因群的ORF2序列長度為702 bp，而1C基因群由于核衣殼蛋白的C末端終止密碼子之前增加了一個(gè)賴氨酸密碼子，其ORF2序列長度變?yōu)?05 bp。Wenliang Li等[4]對(duì)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，PCV2 每個(gè)群都有其特異的氨基酸變異位點(diǎn)，如Y8，R59，R89，E90，S121，A190，E210位點(diǎn)，僅僅為 PCV1A/1B 群所特有的；而 I53，K59，N68，L89，T90，N134，R/ G169，T190，I215，K234為PCV 1C群的特異性的氨基酸位點(diǎn)。本研究的結(jié)果完全符合上述群的特異性位點(diǎn)，這對(duì)于臨床上區(qū)別PCV2基因群具有一定的指導(dǎo)意義。由于ORF2編碼的Cap蛋白中氨基酸的變異對(duì)PCV2的致病性有重要的影響[12]，而Cap蛋白的86-91表位是區(qū)分PCV2a 和PCV2b的重要標(biāo)志之一[13]，這些變異位點(diǎn)對(duì)不同基因群PCV2的抗原性和致病性影響還有待于進(jìn)一步研究。

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Molecular epidemiological surveillance of porcine circovirus type 2 in part of Jiangsu province

Guan Meng，Su Chunhu，Xu Chenxu，Liu Xing，Yang Lin，Lou Yakun，Jiao Kuhua，Chen Sujuan，Peng Daxin，Liu Xiufan
（Key Laboratory of Animal Infectious Diseases，Ministry of Agriculture；Key Laboratory for Avian Preventive Medicine，Ministry of Education；College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

According to the genome sequences of porcine circovirus type 2（PCV2），one pair of primer was designed to detect PCV2 by PCR in 65 samples from the suspected cases of PCV2 infection. The positive samples were inoculated on to Dulac cells and subjected to indirect immunof l uorescence assay. The genome sequences of the isolates were amplif i ed with PCR ，sequenced，and gene typed. The results showed that a total of 21 PCV2 strains was isolated and identif i ed，and all the isolates belonged to genotype 2b，of which 16 isolates were grouped into cluster 1C and 5 isolates were grouped into clusters 1A/1B. The data indicated that PCV2b cluster 1C was the prevailing strain in Jiangsu.

porcine circovirus type 2；isolate；identify；genotype

S852.65

：A

：1005-944X（2014）02-0062-05