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（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海 201203）

貓傳染性腹膜炎病毒核衣殼蛋白的表達(dá)及間接ELISA法的建立

熊煒1，林穎崢1，王艷1，魏曉鋒2，王巧全1，黃忠榮1，胡建華2，李健1

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海 201203）

本研究對貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）N蛋白的編碼基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，并在純化重組N蛋白的基礎(chǔ)上，建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法。研究結(jié)果顯示，該重組純化的N蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性，可用于FIPV陽性血清的篩查，為我國出入境檢疫部門監(jiān)控FIPV疫情提供技術(shù)支撐。

貓傳染性腹膜炎病毒；核衣殼蛋白；基因克隆和表達(dá)；間接ELISA

貓傳染性腹膜炎（FIP）是由貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）引起的貓科動物的一種慢性、漸進(jìn)性、致死性傳染病，以腹膜炎、大量腹水積聚或各種臟器出現(xiàn)肉芽腫病變、致死率較高為主要臨床特征[1-2]。FIPV在分類上屬于套式病毒目（Nidovirus）冠狀病毒科冠狀病毒屬，它與貓腸道冠狀病毒（FECV）同屬于貓冠狀病毒（FCoV）[3]。FIPV的基因型為單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，病毒粒子呈螺旋狀對稱，有囊膜，囊膜表面有花瓣?duì)罾w突，在電子顯微鏡下呈日冕狀。FIPV編碼4種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、小包膜蛋白（E蛋白）和核衣殼蛋白（N蛋白）[3]。1963年Holzworth在美國首次報(bào)道本病，但直到1977年才確定該病病原為冠狀病毒。目前已報(bào)道的檢測FIPV的方法有血清學(xué)檢測、RT-PCR、核酸探針檢測、基因芯片檢測等[4-10]。本研究對FIPV N蛋白基因編碼序列進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，并將其純化后包被ELISA板，初步建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法。

1　材料與方法

1.1主要試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶（Superscript II）購自Invitrogen公司；高保真Taq酶（Pfuultra II）購自Stratagene公司；RNA酶抑制劑、dNTP、DNA Marker（DL2000、DL15000）、 蛋 白Marker、T4 DNA連接酶購自Takara公司；限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I購自NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xid公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Top 10F和BL 21）、氨芐青霉素、質(zhì)粒抽取試劑盒、膠回收試劑盒、TMB試劑均購自天根生化公司；蛋白表達(dá)產(chǎn)物純化采用GE公司的HisTrap HP親和柱及試劑。

1.2病毒FIPV由本室從美國菌種保藏中心（ATCC編號：FIPV-1145）引進(jìn)并保存。將該病毒在狗直腸瘤細(xì)胞系（A72）上擴(kuò)增，細(xì)胞培養(yǎng)物凍融，3000 r/min離心，取上清液備用。

1.3引物參照GenBank中收錄的FIPV毒株的N蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物并在該基因的上下游分別引入BamH I和Not I內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的N蛋白基因大小為1134 bp，其上游引物（FIPVNF）為：5’CGG GAT CCA TGG CCA CAC AGG GAC AAC GCG TC 3’，下游引物（FIPVNR）為：5’CCG CTC GAG GTT CGT AAC CTC ATC AAT CAT CTC 3’。

1.4RNA抽提和目的基因擴(kuò)增取200 μL FIPV細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，加1 mL Trizol試劑，用槍吹打20～30次；加入200μL氯仿，渦旋震蕩30 s混勻；12000 r/min離心15 min；取上層水相，加500 μL異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20 min；12000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀用1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7500 r/min離心10 min；棄上清，沉淀室溫干燥10 min；加20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取10 μL RNA溶液，加5倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液4 μL、0.1 M DTT（二硫蘇糖醇）2μL、dNTP 1 μL、下游引物（FIPVNR）1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶（Superscript II）1 μL，置PCR儀上42℃/50 min、70℃/15 min即得cDNA模板。在PCR管中，加cDNA模板3 μL、10倍Taq酶濃縮緩沖液5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物（FIPVNF和FIPVNR）各0.5 μL、Taq酶（Pfuultra II）1 μL，加水補(bǔ)足總體積至50 μL。將PCR管置PCR儀上，按如下程序擴(kuò)增：首先94℃ 5 min；然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5膠回收和質(zhì)粒的抽提PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體經(jīng)BamH I和Not I酶切后，采用天根生化公司膠回收試劑盒進(jìn)行基因片段的回收，方法見試劑盒說明書；質(zhì)粒抽提采用天根生化公司質(zhì)粒提取試劑盒，方法見試劑盒說明書。

1.6目的基因連接至質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（pET23a）與PCR產(chǎn)物連接采用Takara公司T4 DNA連接酶，操作見試劑說明書。

1.7表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳和Western-blots檢測取500 μL 37℃培養(yǎng)過夜的菌液，6000 r/min離心5 min，得細(xì)菌沉淀懸浮于50 μL PBS中，加入蛋白上樣緩沖液后，煮沸裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（膠濃度12%），分析蛋白電泳條帶。將表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，用HisTrap HP親和柱純化后，進(jìn)行蛋白電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，再使用FIPV陽性血清和用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗貓HRP-IgG作為二抗，進(jìn)行Western-blot，檢測重組蛋白的生物學(xué)活性。

1.8His蛋白的純化通過pET23質(zhì)粒載體在大腸桿菌表達(dá)的FIPV N蛋白末端引入組氨酸（His）的標(biāo)記，采用GE公司生產(chǎn)的HisTrap HP對目的蛋白進(jìn)行純化，具體操作見說明書。

1.9抗原包被濃度與陽性血清稀釋度的確定以純化的重組蛋白為包被抗原，采用方陣試驗(yàn)方法，優(yōu)化抗原包被濃度和陽性血清稀釋濃度。取純化FIPV N蛋白（濃度測定為4.66 μg/mL），用pH8.6磷酸鹽按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128進(jìn)行倍比稀釋，再包被96孔ELISA板，每孔200 μL，4℃過夜；用PBST洗滌三次；每孔加入200 μL 40 g/L PEG20000作為封閉液，37℃封閉2 h；用PBST洗滌三次；將FIPV陽性血清和陰性血清分別按1∶100、1∶200，1∶400稀釋后，加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，37℃作用l h；用PBST洗滌三次；加入1∶2000稀釋的羊抗貓HRP-IgG，每孔100 μL，37℃作用1h；用PBST洗滌三次；加TMB底物顯色液，每孔100 μL，37℃作用15 min；最后每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上450 nm處讀取OD值。以陽性血清的OD值接近1.0，P/N值（陽性血清OD450/陰性血清OD450）≥2.0的抗原最大稀釋度作為抗原的最適工作濃度。

2　結(jié)果

2.1目的基因的RT-PCR擴(kuò)增將FIPV毒株在A72細(xì)胞上擴(kuò)增，提取細(xì)胞培養(yǎng)物中的RNA，采用RT-PCR對FIPV的N蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過引物將在目的基因的5’端和3’端分別引入BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR從FIPV基因組中擴(kuò)增出了條帶單一特異性的基因片段，基因片段大小為1148 bp（去除終止子，并引入17bp的內(nèi)酶切位點(diǎn)）（圖1）。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增FIPV N蛋白基因

2.2目的基因的克隆及產(chǎn)物的酶切鑒定將目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，用BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，將其與同樣進(jìn)行酶切的質(zhì)粒載體pET23a進(jìn)行連接，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10F。經(jīng)平板篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提和酶切鑒定。結(jié)果顯示，隨機(jī)挑取的2個(gè)平板篩選陽性克?。╬ET-23a-FIPV-N1和pET-23a-FIPVN2）的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定均釋放出了與目的基因大小一致的陽性基因片段（圖2），將質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測定并與報(bào)道的FIPV株N蛋白基因（Genbank登錄號：AB086881）比對，其同源性為95.2%。

2.3目的基因的表達(dá)及抗原性鑒定將pET-23a-FIPV-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，轉(zhuǎn)化細(xì)菌搖菌培養(yǎng)6 h后，加入終濃度為1.0 mmol/ L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白表達(dá)產(chǎn)物用SDSPAGE分析。結(jié)果顯示，與空載體對照及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌蛋白電泳圖相比，pET-23a-FIPV-N1轉(zhuǎn)化的細(xì)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其電泳蛋白譜中出現(xiàn)了分子量大小為45 Kda的目的基因表達(dá)產(chǎn)物（圖3）。將表達(dá)的目的蛋白產(chǎn)物，用HisTrap HP親和柱純化后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，并使用FIPV陽性血清進(jìn)行Western-blot分析，證實(shí)電泳蛋白譜中出現(xiàn)的45 Kda的重組蛋白具有良好的FIPV蛋白的反應(yīng)原性（圖4）。

圖2 BamH I和Xho I雙酶切鑒定pET-23a質(zhì)?？寺∪隖IPV的N蛋白基因

2.4FIPV間接ELISA檢測方法的建立經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)測定，建立的FIPV間接ELISA檢測方法中，當(dāng)FIPV陽性血清為l∶100稀釋、FIPV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.17 μg/mL（稀釋倍數(shù)1∶4）時(shí)，陽性血清的OD值接近于1.0，而陰性血清的OD值均較低，分布于0.05～0.2之間（表1）。因此，確定FIPV陽性血清的最佳工作濃度為1∶100，相應(yīng)的FIPV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.17 μg/mL。

圖3 FIPV N蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖

圖4重組FIPV N蛋白純化產(chǎn)物的Western-blot分析

3　討論

貓傳染性腹膜炎在貓群發(fā)病率、死亡率均較高，尤其在多貓家庭和流浪貓聚集地多發(fā)。該病在感染早期無特征性癥狀，出現(xiàn)臨床癥狀后，預(yù)后多不良，目前RT-PCR是檢測該病最常用的方法。國內(nèi)對該病的研究不多，報(bào)道的FIPV的檢測方法有限。由于FIPV是冠狀病毒屬的重要成員，尤其在2004年肆虐全球的“非典”（SARS）之后，人們對冠狀病毒的研究越來越重視。據(jù)報(bào)道，SARS是由一種新型的冠狀病毒（SARS-CoV）引起，它很有可能來源于果子貍，該動物分類上屬于靈貓科動物[11]。因此，監(jiān)控貓科動物特別是野生貓科動物中FIPV的疫情，對控制FIPV的傳播，具有重要的公共健康安全意義。此外，由于FIPV易變異，血清型較多，而其主要結(jié)構(gòu)蛋白之一的N蛋白基因相對保守，可做為核酸檢測和血清學(xué)檢測的良好靶點(diǎn)?；谏鲜霰尘埃谝呀⒘薋IPV核酸檢測方法的基礎(chǔ)上[5，10]，為豐富FIPV檢測技術(shù)體系，本研究對FIPV編碼的N蛋白基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并將重組N蛋白包被ELISA板，初步建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法，該體外重組N蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性，可用于FIPV陽性血清的篩查。后繼，本研究將采用更多的臨床樣本對建立的FIPV間接ELISA方法進(jìn)行優(yōu)化，并對方法的特異性、穩(wěn)定性和可靠性做進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊?，該FIPV抗體間接ELISA檢測方法的建立，為出入境口岸監(jiān)控和診斷進(jìn)境的犬貓科動物特別是貓科野生動物中FIPV疫情提供了重要的技術(shù)支撐。

表1 FIPV N蛋白最佳抗原包被濃度和最佳陽性血清工作濃度的選擇

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Cloning and expression of nucleocapsid protein of feline infectious peritonitis virus and establishment of an indirect ELISA for EIPV

Xiong Wei1，Lin Yingzheng1，Wang Yan1，Wei Xiaofeng2，Wang Qiaoquan1，Huang Zhongrong1，Hu Jianhua2，Li Jian1
（1．Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；2．Shanghai Laboratory Animal Research center，Shanghai 201203）

In this study，the gene of nucleocapsid protein（N protein）of feline infectious peritonitis virus（FIPV）was cloned and expressed in Escherichia coli. And an indirect ELISA method was established with the purif i ed recombinant N protein. The results showed this recombinant N protein had perfect antigen reactivity of FIPV and could be used to screen FIPV positive serum，and the study was helpful to monitor the FIPV infection status.

feline infectious peritonitis virus；nucleocapsid protein；gene cloning and expression；indirect ELISA

S852.659.6；S858.293

：A

：1005-944X（2014）02-0067-04

上海市科委科研項(xiàng)目（課題編號11140901100）