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（廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527400）

廣東省部分豬場(chǎng)細(xì)環(huán)病毒感染狀況

王東東，鄧雨修，李春梅，盧 圍，廖承球，潘永飛，周慶豐，宋延華

（廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527400）

細(xì)環(huán)病毒（TTV）目前在全世界的豬群中廣泛存在。為了調(diào)查其在廣東省豬群流行情況，我們運(yùn)用PCR方法對(duì)廣東省不同地方豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶送檢的445份血清進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：TTV總的陽(yáng)性率為68.1%（303/445），其中TTV1陽(yáng)性率為43.1%（192/445），TTV2陽(yáng)性率為24.9%（111/445）。TTV1的陽(yáng)性率高于TTV2的陽(yáng)性率，且豬場(chǎng)送檢樣品陽(yáng)性率高于散養(yǎng)戶。TTV1和TTV2存在混合感染，豬場(chǎng)樣品混合陽(yáng)性率為23.1%（88/381），散養(yǎng)戶樣品混合陽(yáng)性率為1.6%（1/64）。幾份陽(yáng)性樣品測(cè)序和進(jìn)化分析顯示，它們分別屬于TTV1和TTV2。調(diào)查結(jié)果表明TTV在廣東豬群中已經(jīng)廣泛存在。

細(xì)環(huán)病毒；UTR基因；流行病學(xué)

（細(xì)環(huán)病毒，TTV）在1997年日本的一例輸血性肝炎病人身上首次發(fā)現(xiàn)[1]。TTV歸屬于圓環(huán)病毒科，指環(huán)病毒屬?；蚪M為單鏈負(fù)鏈的環(huán)狀DNA，約3.8kb左右，分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)（UTR）兩部分。TTV編碼區(qū)由6個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1～ORF6）組成，TTVs具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，但核酸序列差別較大。有學(xué)者根據(jù)UTR將TTV分為5個(gè)基因型群（genetic group）[2]。目前已知感染的動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類、豬、禽、綿羊、牛、狗和貓等[3-4]。豬的TTV主要包括兩大基因群TTV1和TTV2。據(jù)國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果顯示[5]，不同地區(qū)的感染率為24%～100%。目前普遍認(rèn)為TTV是非致病的，但有學(xué)者研究結(jié)果顯示[6]TTV2與PCV2流行有一定相關(guān)，并可能與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）之間存在一定的聯(lián)系。

基于UTR區(qū)基因序列的PCR方法是診斷TTV感染的主要手段[3-7]，本研究中我們運(yùn)用兩對(duì)PCR引物，分別對(duì)TTV1和TTV2進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其感染情況進(jìn)行了調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1血清

445份血清來(lái)自廣東省17個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的正常豬群以及表現(xiàn)發(fā)燒、消瘦、體況較差的豬只和5個(gè)散養(yǎng)戶正常豬群送檢血清。

1.1.2試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Premix Taq購(gòu)自Takara公司。

1.2方法

1.2.1引物

根據(jù)Kekarainen T 等[12]的方法設(shè)計(jì)兩對(duì)引物TTV1-F/TTV1-R和TTV2-F/TTV2-R，送上海生工合成，用于TTV PCR擴(kuò)增，詳見(jiàn)表1。

表1擴(kuò)增用引物序列

1.2.2核酸提取

參照天根公司DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3TTV1與TTV2的PCR擴(kuò)增與鑒定

以血清提取的DNA作為模板，用相應(yīng)引物按下述體系配制：Premix-Taq12.5 μL，20 pmol/L上、下游引物各0.5μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72℃ 延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將目的片段克隆至pMD18-T載體。經(jīng)鑒定后，將陽(yáng)性克隆送Takara公司測(cè)序。

1.2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)繪制

用Clustal X對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。DNA Star軟件進(jìn)行序列同源性比較。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增電泳鑒定

用血清提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了預(yù)期大小的目的片段（圖1、圖2）。

2.2檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

對(duì)445份血清樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明TTV總的陽(yáng)性率為68.1%（303/445），見(jiàn)表2。

2.3同源性比較結(jié)果

圖1 TTV1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 TTV2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

經(jīng) 過(guò) D N A S t a r比 對(duì) 發(fā)現(xiàn) ，本 研 究 中 所 測(cè) T T V 1和 TTV2之間的同源性分別為91.5%～96.1%和92.8%～98.4%，與參考毒株相比同源性分別為88.0%～96.7%和81.2%～100%（圖3、圖4）。

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

本研究擴(kuò)增序列經(jīng)測(cè)序后和參考序列用Clustal X進(jìn)行比對(duì)并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，所測(cè)序列分屬兩個(gè)基因群：TTV1和TTV2，與預(yù)期結(jié)果相符，其中Shalan A與Shalan B以及YunheA和Yunhe B為同一份樣品中同時(shí)檢出TTV1和TTV2。

3 討論

圖3 TTV1同源性比較

圖4 TTV2同源性比較

圖5 TTV1和TTV2進(jìn)化樹(shù)分析

TTV在豬群中已經(jīng)普遍存在，Kekarainen T等[4]的研究顯示TTV在豬群中的陽(yáng)性率為72%。我們對(duì)廣東省17個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)和5戶散養(yǎng)戶豬群的檢測(cè)結(jié)果顯示TTV的陽(yáng)性率為68.1%，TTV1和TTV2陽(yáng)性率分別為43.1%和24.9%，證實(shí)TTV在廣東存在較高的感染率，并且TTV1陽(yáng)性率要高于TTV2。這與Kekarainen T 等[7]和Sibila M 等[8]的研究結(jié)果一致，但與Segalés J 等[9]和王礞礞等[10]的研究結(jié)果不盡相同，可能是由所調(diào)查豬群的數(shù)量、方法以及豬群本身的差異所致。

在我們對(duì)散養(yǎng)戶檢測(cè)的64份樣品中，TTV1和TTV2各檢出了三份陽(yáng)性樣品（均為4.7%），遠(yuǎn)低于豬場(chǎng)的TTV陽(yáng)性檢出率（49.6%和28.3%）。所檢散養(yǎng)戶飼養(yǎng)的豬品種多為土豬，而豬場(chǎng)的豬品種為經(jīng)培育后的三元雜豬。兩者TTV感染率相差極大，是TTV的感染與豬的品種有關(guān)，還是三元雜豬的免疫力不及土豬所致，或是養(yǎng)殖密度高使得病毒更易傳播，需要進(jìn)一步收集資料進(jìn)行研究，

目前TTV感染在豬群引起何種疾病仍未有報(bào)道。有學(xué)者的研究結(jié)果表明，TTV和豬的PMWS之間存在一定相關(guān)。Ellis JA等[11]單獨(dú)接種TTV1、PCV2或者先接種PCV2再接種TTV1不引起豬的臨床癥狀，但是先接種TTV1再接種PCV2，12頭豬有6頭出現(xiàn)急性的PMWS。Kekarainen T 等[6]發(fā)現(xiàn)在PMWS豬群中TTV2的陽(yáng)性率（91%）要高于非PMWS豬群（72%）。

另外，Krakowka S 等[12]檢測(cè)了22個(gè)商業(yè)化的豬肺炎支原體疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13個(gè)檢測(cè)到TTV1和TTV2的DNA。我們也對(duì)手頭的3個(gè)國(guó)產(chǎn)的藍(lán)耳病疫苗進(jìn)行了檢測(cè)，并沒(méi)有檢到TTV的DNA存在。雖然檢到病毒的基因組病毒并不代表其仍然具有感染性，但是仍然具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，有文獻(xiàn)表明TTV同屬的PCV2在接種全基因組到豬后可以檢到病毒血癥。因此，疫苗中存在的TTV核酸具有潛在的感染危險(xiǎn)，今后對(duì)疫苗亦應(yīng)加強(qiáng)檢測(cè)。

隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疾病成為困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大問(wèn)題。TTV作為一種潛在致病病毒，較高的陽(yáng)性率應(yīng)該引起我們的重視。TTV的致病性以及與其他疾病之間的關(guān)系，需要我們進(jìn)行深入的研究。

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An Inestigation of TTV Infection in Some Swine Herds in Guangdong Province

Wang Dongdong，Deng Yuxiu，Li Chunmei，Lu Wei，Liao Chengqiu，Pan Yongfei，Zhou Qingfeng，Song Yanhua
（GUANGDONG WENS FOODSTUFF GROUP CO.LTD，Xinxing，Guangdong 527400）

Torque teno virus（TTV）was present in swine the world wide.To investigate the situation of TTV in swine of Guangdong province，a PCR was used to detect 445 serum samples from different swine herds and free-ranging households.The result showed that the total positive rate was 68.1%（303/445）， 43.1%（192/445） positive for TTV1 and 24.9%（111/445） for TTV2 .The positive rate of TTV1 was higher than that of TTV2.Co-infection with TTV1 and TTV2 was existed and the positive rate of herds was 23.1%（88/381）and that of the free-ranging households was1.6%（1/64）.The sequencing and phylogenetic analysis showed that they belonged to two clusters：TTV1 and TTV2. The investigation demonstrated that TTV was widely existed in swine in Guangdong provine.

Torque teno virus；UTR gene；Epidemiology

S852.65

：A

：1005-944X（2014）02-0059-04